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研究目的本论文通过建立高氧肺损伤动物模型和细胞模型,对组织和细胞中miR-20b表达进行了检测,意在阐述miR-20b与高氧肺损伤的关系;着重研究miR-20b对肺上皮细胞线粒体功能和细胞凋亡的作用;通过验证miR-20b与MFN1/MFN2的靶向关系,探讨miR-20b和MFN1/MFN2在高氧肺损伤发生机制中的作用。研究方法第一部分选取体重为200-220g的雄性SD大鼠,随机分为正常对照组和高氧肺损伤（HALI）组。HALI组大鼠置于氧浓度维持在95%的氧箱中,并持续暴露48h,建立高氧肺损伤模型。收集大鼠肺组织,经HE染色、Masson染色、TUNEL染色,观察肺组织的病理变化;采用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平,并检测超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）以及过氧化氢酶（CAT）等因子的水平;采用ELISA检测肺组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性;应用RT-qPCR检测肺组织中miR-20b表达。第二部分将大鼠AECⅡ细胞分为两组:Control组和H2O2组（500 μM H2O2处理48 h）,使用流式细胞仪检测两组ROS的水平、细胞凋亡比例,JC-1染色检测两组线粒体膜电位,通过荧光原位杂交和RT-qPCR检测miR-20b的表达水平。AECⅡ细胞分别转染 miR-20b 和 NC mimic,再经 500 μM H2O2 处理 48h,分为 NC mimic 组、H2O2+NC mimic组和H2O2+miR-20b mimic组,比较三组miR-20b表达水平、ROS的水平、线粒体膜电位和细胞凋亡比例。第三部分利用Targetscan软件预测miR-20b潜在靶基因,并结合双荧光素酶报告实验验证miR-20b与MFN1/MFN2基因靶向关系。AECⅡ细胞分为四组,分别转染NC mimic、miR-20b mimic、NC inhibitor、miR-20b inhibitor,通过 RT-qPCR 和 Western blot检测miR-20b对MFN1/MFN2基因和蛋白表达的影响。Western blot检测高氧损伤后AECⅡ细胞中MFN1和MFN2蛋白表达的变化。挽救实验验证miR-20b通过调控MFN1/MFN2来发挥保护作用,依次将细胞分为H2O2组、H2O2+miR-20b mimic组、H2O2+miR-20b mimic+MFN1 OE 组、H2O2+miR-20b mimic+MFN2 OE 组,通过 Western blot检测各组MFN1和MFN2的蛋白表达水平,并检测各组Cleaved PARP、Cleaved caspase-3的蛋白水平,通过流式检测各组细胞凋亡比例。建立高氧肺损伤动物模型,验证miR-20b靶向调控MFN1/MFN2减轻肺损伤的作用。将大鼠分为Hyperoxia组、Hyperoxia+miR-20b mimic 组、Hyperoxia+miR-20b mimic+MFN1 OE 组、Hyperoxia+miR-20b mimic+MFN2 OE 组,通过 Western blot 检测各组 MFN1 和 MFN2 的蛋白表达水平,并检测各组Cleaved PARP、Cleaved caspase-3的蛋白水平,通过HE染色检测每组大鼠肺组织病理变化。研究结果第一部分与正常对照组相比,HALI组大鼠肺组织HE染色可见肺泡结构紊乱、肺泡破裂、肺泡壁水肿、肺泡间隔不完整,肺泡及间质可见炎性细胞浸润,Masson染色显示HALI组大鼠肺组织的纤维化水平明显升高,TUNEL染色表明HALI组大鼠肺组织的细胞凋亡明显增高。与正常对照组相比,HALI组肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β表达量显著上调（P＜0.01）。HALI组大鼠肺泡灌洗液中抗氧化因子SOD和CAT水平显著降低（P＜0.01）,而MDA和NO水平明显升高（P＜0.01）。ELISA检测显示,HALI组肺组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性较正常对照组明显降低（P＜0.001）。与正常对照组相比,HALI组大鼠肺组织中miR-20b的表达水平下降了 66%（P＜0.001）。第二部分与正常对照组相比,H2O2氧化损伤组细胞内ROS水平显著升高,线粒体膜电位显著下降（P＜0.01）,经H2O2干预后AEC Ⅱ凋亡比例明显升高（29.69%vs 11.81%,P＜0.001）。与正常对照组相比,H2O2氧化损伤组细胞中miR-20b的表达量降低了 43%（P＜0.01）。与NC mimic组相比,H2O2+NC mimic组的 miR-20b 的表达下降65%（P＜0.001）;而 miR-20b 模拟物转染后,与 H2O2+NC mimic 组相比,H2O2+miR-20bmimic 组 miR-20b表达升高115倍（P＜0.001）。与NC mimic组相比,H2O2+NC mimic组线粒体膜电位下降,ROS 水平升高,细胞凋亡比例由14.31%增加至34.78%（P＜0.01）;与H2O2+NC mimic组相比,过表达miR-20b后细胞线粒体膜电位显著提高,细胞内ROS水平明显降低,细胞凋亡比例由34.78%下降至18.43%（P＜0.001）。第三部分TargetScan数据库预测显示miR-20b与MFN1和MFN2 3’-UTR具有很好的结合能力。荧光素酶报告实验结果显示miR-20b与MFN1和MFN2存在靶向作用关系。与NC mimic组相比,上调miR-20b能显著降低MFN1 mRNA和MFN2 mRNA的表达水平（P＜0.001）;而与NC inhibitor组相比,抑制miR-20b的表达能够明显上调MFN1 mRNA 和 MFN2 mRNA 的表达水平（P＜0.001）。Western-blot 检测显示:与NC mimic组相比,上调miR-20b能显著降低MFN1蛋白和MFN2蛋白的表达（P＜0.001）;而与NC inhibitor组相比,抑制miR-20b的表达则显著上调MFN1蛋白和MFN2的蛋白的表达（P＜0.001）。结果表明,在AECⅡ细胞中,miR-20b能够负向调节MFN1和MFN2基因和蛋白的表达水平。Western-blot检测显示:与正常对照组相比,H2O2组AECⅡ细胞中MFN1和MFN2蛋白表达明显上升,说明高氧损伤可诱导MFN1和MFN2过度表达。挽救实验表明:转染miR-20b mimic使氧化损伤细胞中MFN1和MFN2的表达分别下降了 44%和52%（P＜0.01）,共转染MFN1质粒或MFN2质粒后两组细胞中MFN1和MFN2蛋白水平分别提高了 1.63倍和1.65倍（P＜0.001）,说明过表达MFN1和MFN2能够抵消miR-20b对MFN1和MFN2的抑制作用。转染miR-20b mimic使氧化损伤细胞中Cleaved PARP和Cleavedcaspase-3的表达分别下降了 58%和52%（P＜0.01）,细胞凋亡比例降低至20%（P＜0.01）;共转染MFN1质粒后使Cleaved PARP和Cleavedcaspase-3的表达分别上升了 2.05倍和1.5倍（P＜0.01）,细胞凋亡比例上升至 43.03%（P＜0.01）;共转染 MFN2 质粒后使 Cleaved PARP 和 Cleaved caspase-3的表达分别上升了 2.1倍和1.63倍（P＜0.01）,细胞凋亡比例上升至43.09%（P＜0.01）。结果表明过表达MFN1或MFN2可以加剧氧化损伤AECⅡ细胞的凋亡,并且可以逆转过表达miR-20b所发挥的保护作用。动物水平验证miR-20b通过调控MFN1/MFN2发挥高氧肺损伤后的肺保护作用。与 Hyperoxia 组相比,Hyperoxia+miR-20b mimic 组肺组织 MFN1 和 MFN2 的表达显著下降（P＜0.001）,与 Hyperoxia+miR-20b mimic 组相比,Hyperoxia+miR-20b mimic+MFN1 OE 组中 MFN1 蛋白水平和 Hyperoxia+miR-20b mimic+MFN2 OE 组中MFN2蛋白水平显著提高（P＜0.001）,说明过表达MFN1和MFN2能够抵消miR-20b对MFN1和MFN2的抑制调控作用。与Hyperoxia组相比,H2O2+miR-20bmimic组大鼠肺组织中Cleaved PARP和Cleavedcaspase-3的表达显著下降;Hyperoxia+miR-20b mimic+MFN1 OE组和Hyperoxia+miR-20b mimic+MFN2 OE 组中 Cleaved PARP和Cleaved caspase-3的表达均显著上升（P＜0.001）。HE染色显示:Hyperoxia组大鼠肺泡间质有大量红细胞渗出,存在中度水平的炎症浸润,肺泡壁增厚且肺泡腔部分扩张;Hyperoxia+miR-20b mimic组仅有局部存在少量红细胞渗出,无显著炎症浸润,肺泡结构基本完整;Hyperoxia+miR-20b mimic+MFN1 OE 组与 Hyperoxia+miR-20b mimic+MFN2 OE组情况接近,肺泡间质有部分红细胞渗出,存在轻度水平的炎症浸润。以上结果说明:过表达MFN1或MFN2可以加剧氧化损伤肺组织的凋亡,并且可以逆转过表达miR-20b所发挥的保护作用。结 论1.高氧暴露可导致大鼠肺部炎症反应加重,抗氧化能力减弱,线粒体酶活性下降,诱导细胞凋亡。miR-20b在HALI模型中表达降低,与高氧肺损伤的发生发展密切相关。2.miR-20b能够降低高氧损伤AECⅡ细胞ROS水平,提高线粒体膜电位,抑制细胞凋亡,缓解高氧肺损伤。3.高氧损伤后MFN1和MFN2的表达明显上升,诱导caspase依赖的细胞凋亡。miR-20b通过靶向MFN1和MFN2抑制线粒体途径介导的细胞凋亡,从而减轻高氧肺损伤。4.miR-20b有可能成为治疗HALI的潜在靶点。