第一部分：可卡因对大鼠中脑-边缘多巴胺能神经系统AMPK活性的影响　　目的:皮质-中脑边缘多巴胺通路是大脑奖赏系统的重要组成部分,介导药物成瘾、食欲、性欲等奖赏行为以及精神系统疾病如抑郁症、精神分裂症等的发病过程。腺苷酸激活蛋白激酶AMPK(AMP-activated protein kinase)作为一个能量感受器,参与机体能量内稳态的调控过程。AMPK活性状态与食欲密切相关,而食物奖赏和药物奖赏在很多情况下都遵循相同的机理,因此我们推测AMPK也可能与药物成瘾有关。为了证实这一假设,我们首先利用western免疫印迹(western blot)的方法,观察离体脑片孵育可卡因对大鼠奖赏系统 AMPK活性的影响。由于可卡因的药理作用主要是通过阻断多巴胺转运体功能从而增加突触间隙多巴胺含量,我们进一步通过使用阻断剂研究可卡因的效果是否是多巴胺受体依赖性的,并使用选择性多巴胺激动剂直接激活多巴胺受体,观察多巴胺受体激动剂是否能模拟可卡因的效果。为了探索整体水平上可卡因是否发挥同样的作用,我们还观察了腹腔注射可卡因后大鼠AMPK水平的变化情况。　　方法:首先在离体水平进行研究。使用可卡因孵育大鼠脑片后,急性分离前额皮层(PFC)、纹状体(CPu)和伏隔核(NAc)等奖赏相关区域,观察这些脑区AMPK磷酸化水平的变化情况。使用多巴胺受体阻断剂预处理大鼠脑片15 min后,再给予可卡因孵育脑片,观察这些脑区 AMPK磷酸化水平的变化情况。使用多巴胺受体激动剂处理脑片,观察多巴胺受体激动剂对上述脑区 AMPK磷酸化水平的影响。其次在整体水平进行研究,分别急性和慢性给予大鼠腹腔注射可卡因并提取伏隔核(NAc)和纹状体(CPu)区组织蛋白,用western blot的方法检测AMPK磷酸化水平的变化情况。　　结果:不同浓度(1μM、10μM、100μM)的可卡因急性处理脑片20 min后,AMPK磷酸化水平在各脑区均表现为浓度依赖性的增加。NAc和PFC区AMPK的激活程度在10μM时最为显著,而CPu区则是在1μM时最为显著。进一步对NAc和CPu区的实验发现,多巴胺D1受体阻断剂SCH23390(10μM)预处理可取消可卡因引起的NAc区AMPK激活,而D2受体阻断剂不影响可卡因对该脑区AMPK的激活作用;D2受体阻断剂sulpiride(10μM)预处理可取消可卡因引起的CPu区 AMPK激活,而D1受体阻断剂不影响可卡因对该脑区AMPK的激活作用。此外,D1受体激动剂 SKF83959(10μM)显著上调 NAc区域AMPK磷酸化水平;D2受体激动剂quinpirole dihydrochloride(1μM)显著增加CPu区的AMPK活性。　　整体水平的实验结果显示,单次给予可卡因的大鼠30 min时奖赏脑区AMPK磷酸化表达显著增加,60 min时恢复到正常水平。提示单次可卡因暴露可短暂激活奖赏系统的AMPK。连续给予7天可卡因后,大鼠CPu和NAc区总的AMPK含量无变化,而AMPK磷酸化水平明显增加,该变化在戒断后第14天仍持续存在。　　结论:可卡因可通过激动不同多巴胺受体来上调成瘾相关脑区NAc和CPu的AMPK活性。急性可卡因暴露可短暂激活AMPK,而慢性可卡因暴露可导致AMPK激活的持续激活,这种持久存在AMPK激活有可能介导了动物的成瘾和戒断行为。　　第二部分：可卡因激活大鼠中脑-边缘多巴胺能神经系统AMPK的机制　　目的:AMPK的活性受能量状态(AMP/ATP比值)、某些激酶如LKB1和胞内钙信号等多种因素的调节。本研究利用高效液相色谱法(HPLC)和Western免疫印迹法,研究可卡因引起奖赏相关脑区 AMPK活性变化的潜在机制。鉴于离体水平下,可卡因调节NAc和CPu的AMPK活性依赖不同多巴胺受体并且多巴胺受体激动剂可以模拟可卡因效果,因此,为避免另一种多巴胺受体的干扰,我们通过使用多巴胺激动剂来研究AMPK激活的机制。而有关整体水平的研究,鉴于NAc与成瘾形成和戒断行为更为密切,我们进一步研究导致成瘾和戒断大鼠NAc区AMPK激活的因素。　　方法:用多巴胺激动剂(可卡因、选择性多巴胺激动剂)孵育大鼠脑片15-20 min后,检测各相关脑区 AMPK激活因子如AMP/ATP比值、LKB1、nNOS和CaMKII的表达情况,并用钙离子螯合剂降低胞内钙离子水平研究钙离子对AMPK激活的必要性。　　整体动物实验,以生理盐水作为对照,模型大鼠分为4组:单次腹腔注射盐酸可卡因(15 mg/kg)后30 min取组织提蛋白;单次腹腔注射盐酸可卡因(15 mg/kg)后60 min取组织提蛋白;连续7天腹腔注射盐酸可卡因(15 mg/kg,每天一次)并于24小时后取组织提蛋白,即成瘾模型组;连续7天腹腔注射盐酸可卡因(15 mg/kg,每天一次)并戒断14天后取组织提蛋白,即成瘾戒断组。用western blotting的方法检测NAc和CPu区AMPK及其调节因子的变化情况。　　结果:离体脑片的HPLC结果发现多巴胺受体激动并不影响NAc和CPu区AMP/ATP比值,提示短时间激动多巴胺受体(15min)不会改变组织的能量状态。而western blot实验发现D1受体激动剂可显著促进NAc区CaMKII磷酸化水平和nNOS的表达;D2受体激动剂也显著增加CPu区CaMKII活性和nNOS表达。但激动D1和D2受体对LKB1的活性水平均无明显影响。这些结果提示由可卡因引起的多巴胺受体激动主要是通过调控胞内钙离子信号来调节 AMPK活性。使用胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM(5μM)孵育脑片螯合胞内钙离子后再给予多巴胺受体激动剂,发现减少胞内钙离子水平可有效抑制多巴胺受体激动引起的NAc和CPu区AMPK激活。整体水平western blot实验发现,与生理盐水对照组相比,可卡因成瘾和戒断大鼠NAc区AMP/ATP比值、CaMKII磷酸化水平和nNOS表达均增加,而磷酸化LKB1水平没有变化。　　结论:短时间多巴胺受体激动引起的奖赏相关脑区 AMPK信号激活不依赖于能量状态。AMPK信号的激活主要是通过CaMKII/nNOS等Ca2+信号途径,而与LKB1的调节无关。钙离子螯合剂取消多巴胺受体激动引起AMPK激活证实了可卡因对奖赏相关脑区 AMPK磷酸化水平的调节是钙离子依赖的。与离体脑片AMPK激活结果不同,慢性整体给药引起的AMPK激活与胞内钙信号和能量状态均相关有关。