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在牦牛卵巢中,卵泡闭锁是一种周期性过程,颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因,凋亡是多基因严格控制的过程。近年来的研究证明,生殖激素对卵泡发育起重要作用,FSH能通过阻止颗粒细胞的凋亡来抑制卵泡闭锁,促进卵泡发育,但目前对其分子机制尚不十分清楚。本论文选用牦牛卵泡颗粒细胞为研究对象,采用细胞培养、q RTPCR、免疫组织化学方法、ELISA法和Western blotting法,分析FSH对颗粒细胞FSHR的调节、FSH对FOXO3a及凋亡相关基因Fas、Fas L、Bax、Bcl-2、Bim、BCL-xl、Caspase-3 m RNA表达水平的调节作用。从死亡受体通路和线粒体通路综合分析FSH如何通过FOXO3a对凋亡相关基因转录水平的调节作用。通过相关细胞因子b FGF、EGF、LIF、TNF-α的分泌情况,分析FSH对细胞体外分泌b FGF、EGF、LIF、TNF-α的调节作用,并进一步分析细胞因子调节的相关基因c-fos、Akt、Oct-4、NF-k B和Caspase-6的表达,分析FSH对细胞因子分泌的调控作用机制。综合分析FSH调控GCs的分子机制。研究结果表明:细胞鉴定结果可知,颗粒细胞细胞特异性表达FSHR。500ng/mL FSH作用6h实验组FSHR m RNA有最高表达,100ng/mL FSH作用24h实验组FSHR m RNA表达量最低。30组处理实验中,FSHR m RNA水平表达量由高到低的四组依次为:6h 500ng/mLFSH>3h 100ng/mLFSH>6h 200ng/mL FSH>6h 10ng/mL FSH。500ng/mL FSH作用6h后,FSHR蛋白表达量最高,其次是3h添加100ng/mLFSH实验组FSHR表达量较高。500ng/mL FSH作用6h FSHR蛋白表达量最高约为45.32。通过以上实验可知,牦牛FSH诱导FSHR实验结果表明:当向培养液中添加500ng/mL FSH作用6h时FSHR m RNA表达量最高。WB实验结果与RT-q PCR结果一致。FSH诱导下游c AMP表达实验结果表明,当添加100ng/mL的FSH作用3h时,c AMP有最高表达值154.218 mol/mL。当添加500ng/mL FSH作用3h时c AMP表达量较高,100ng/mL的FSH作用3h约为500ng/mL FSH作用表达量的2.5倍。10、100、200、500ng/mL FSH作用6h后c AMP的表达基本没有变化且普遍偏低。FSH联合血清诱导的牦牛GCs FOXO3a和FOXO3a(Ser253)核位移动态表达实验结果如下:FOXO3a结果显示,完全培养基中添加500ng/mL FSH作用6h实验组中Foxo3a只表达于细胞质,完成出核且表达较强。不同时间点检测结果显示,Foxo3a在60min、120min及300min均表达于细胞质和细胞核。180min和360min主要表达在细胞质中,细胞核中未见表达。Foxo3a(Ser253)蛋白检测结果可知:向完全培养基中添加500ng/mL FSH Foxo3a(Ser253)可主要表达于细胞质,核中未见表达。当500ng/mL FSH作用60min时Foxo3a(Ser253)未完成完全出核,虽然部分发生核位移,但在细胞质中仍有表达。但并未完全完成核内蛋白的核转位,表达较弱。120min时细胞质和细胞核表达较强。当Foxo3a(Ser253)在3h会发生完全核转移,完全表达在细胞质中,但表达较弱。通过反复验证,240min实验组存在出核和在核的两种结果,说明在4h时Foxo3a(Ser253)表达不稳定。在5h时有出核表达,全部表达在细胞质中,大部分细胞核未见表达,完成出核过程,且在细胞质强表达。6h时Foxo3a(Ser253)完全表达于含有无血清,500ng/mLFSH完全培养基处理的颗粒细胞的细胞质中,细胞核中未见表达。表达较强且稳定。FSH对Foxo3a、Bim、BCL-xl、Fas、Fas L、Bax、Bcl-2和Caspase-3作用机制研究结果表明:500ng/mL FSH可显著上调Foxo3a的表达。在上调Foxo3a的同时可显著下调Bim、Bax、Bcl-2、BCL-xl、Fas L、Fas和Caspase-3的m RMA表达。下调的Bim和Bcl-x L比例约为1:1,Bax和Bc L-2的比例约为1:1。100ng/mL FSH可提高Foxo3a表达的同时降低Bax和Bcl-2的表达,但下调效果没有500ng/mL实验组显著。对Bim和Bcl-x L没有显著下调作用,Bc L-x L与Bim的比例近乎2:1,Bax和Bc L-2的比例近乎1.247:1。Fas L呈显著下调趋势,500ng/mL FSH全培处理组表达量最低,Fas同样在500ng/mL FSH全培处理组表达量最低。生长因子表达检测结果可知:生长因子随剂量和时间变化而逐渐升高,在500ng/mL FSH处理24h后LIF、b FGF和EGF三个蛋白的表达达到最高峰,TNF-α有下降趋势且表达相对较低。进一步选取3h,6h和24h 500ng/mL处理组OD值进行比较可知,表达趋势如上所述,其中LIF、b FGF和EGF在24h表达较高,TNF在6h有较低表达。选取6h和24h做进一步实验检测。选择不含血清的阴性对照组,含血清不含FSH的阳性对照组,500ng/mL FSH作用6h/24h基培/全培实验组对其下游进行c-fos,Akt,NF-k B,Oct-4和Caspase-6m RNA水平的表达检测。检测结果显示,24h 500ng/mLFSH含血清处理组在LIF,EGF,b FGF蛋白分泌增多的情况下,可下调REF和Akt m RNA表达,上调Oct-4和c-fos m RNA表达。综上所述,体外培养条件下向GCs中添加500ng/mL FSH作用6h可增强FSHR表达,100ng/mL FSH作用3h可显著上调c AMP表达。使Foxo3a在3h开始发生核转移,全部转移到细胞质中,并抑制持续到6h,在4h时存在不稳定表达,5h有一个增强的表达,6h全部出核并稳定表达在细胞质中;在Foxo3a发生核位移的同时可显著下调死亡受体通路,线粒体通路及Caspase相关基因的表达。500ng/mLFSH处理24h GCs后,可增加生长因子LIF、b FGF、EGF和TNF-α因子的分泌,可下调REF、Akt和Caspase-6 m RNA表达,上调Oct-4和c-fos m RNA表达。对增殖相关基因表达有上调作用。本实验确定了FSH作用颗粒细胞的最佳作用剂量和时间,明确了FSH联合血清作用下的不同处理组对Foxo3a表达位置的影响,并发现FSH可能是通过调控Foxo3a蛋白表达位置的改变来抑制卵泡颗粒细胞的凋亡,促进细胞增殖基因表达,促进生长因子分泌。研究结果为进一步揭示FSH在卵泡颗粒细胞对卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中的作用机制提供了理论依据,有助于牦牛胚胎体外发育技术改进。