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目的结直肠癌是目前世界范围内发病率及死亡率均位列第三位的恶性肿瘤。在我国,其发病率仍呈上升趋势。研究结直肠癌的发病机制是未来结直肠癌防治工作的基础。探究抑癌基因甲基化与结直肠癌发生发展关系又是目前结直肠癌发病分子机制挖掘的热门方向。故本研究旨在探讨前期通过测序技术筛选获取的TMEM196的甲基化在结直肠癌发生发展中的功能及分子机制。方法1通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库、基因表达集（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库、人蛋白图谱（Human Protein Atlas,HPA）数据库和逆转录聚合酶链式反应（Reverse Tanscription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）查询及检测TMEM196在结直肠癌组织中的表达水平及甲基化水平。利用Methy Light微滴式数字PCR（Methy Light Droplet Digital PCR,Methy Light dd PCR）技术检测健康志愿者与结直肠癌患者血浆中游离脱氧核糖核酸（Circulating Free Deoxynucleic Acid,cf DNA）中TMEM196甲基化的差别,分析血浆cf DNA TMEM196甲基化水平对结直肠癌的诊断效能。通过对不同表达水平及甲基化水平的患者进行生存分析比较,分析TMEM196表达及甲基化水平与预后的关系。通过GEO数据库中人结直肠癌细胞株HCT116的去甲基化测序数据查询及细胞去甲基化实验分析TMEM196甲基化与表达的关系。2选取常见的人结直肠癌细胞系,通过RT-PCR技术检测TMEM196 m RNA的表达水平,并选取细胞株建立过表达TMEM196的细胞模型,利用RT-PCR及蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）验证细胞模型的TMEM196过表达水平。分别通过细胞计数试剂（Cell Counting Kit-8,CCK8）和细胞克隆形成实验进行细胞增殖实验,采用Transwell小室进行细胞迁移侵袭实验,采用流式细胞术（Flow cytometer,FCM）和吖啶橙/溴乙啶（Acridine orange/Ethidium bromide,AO/EB）进行细胞周期检测和细胞凋亡检测,裸鼠皮下成瘤及免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）实验进行体内增殖能力检测。3利用基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）方法分析TCGA数据库及GEO数据库结直肠癌数据集中TMEM196富集的信号通路,WB、TOP/FOP-FLASH以及免疫荧光（Immunofluorescence,IF）实验被用于分析TMEM196所影响的信号通路。在线工具STRING,Bio GRID,Pathway Commons被用于TMEM196相互作用蛋白的分析。免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）、WB、IHC被用于TMEM196对结直肠癌发生发展的具体机制探究。结果1 TMEM196在人结直肠癌组织中m RNA表达低于癌旁正常组织。同时,TMEM196 m RNA表达水平降低与不良预后相关。人结直肠癌组织中TMEM196启动子区域多个Cp G位点甲基化水平显著升高,并且结直肠癌患者血浆cf DNA中TMEM196甲基化检出率明显高于健康志愿者。TMEM196启动子区域多个Cp G位点甲基化水平升高与结直肠癌患者不良预后也存在显著关系。去甲基化药物处理后,TMEM196的m RNA表达水平恢复。2人结直肠癌细胞株HCT116及Lo Vo细胞的TMEM196 m RNA表达水平低,构建过表达细胞模型后,发现过表达TMEM196的HCT116及Lo Vo细胞增殖能力减弱,细胞迁移及侵袭能力减弱,细胞周期被阻滞在G2/M期,细胞凋亡比例增加。裸鼠皮下成瘤实验显示过表达TMEM196的HCT116及Lo Vo细胞在体内增殖能力减弱。3 GSEA显示TMEM196的表达富集于Wnt信号通路,过表达TMEM196的HCT116及Lo Vo细胞active-β-catenin、c-myc及cyclin-D1表达下降,p-β-catenin表达升高,总的β-catenin无明显改变。TOP/FOP-FLASH显示TMEM196过表达可显著抑制β-catenin/TCF活性。Co-IP实验显示TMEM196与组蛋白H2B存在相互作用,并且在TMEM196过表达细胞中,与组蛋白H2B结合的USP22减少,RNF20、RNF40、USP44变化不明显。组蛋白H2B第120赖氨酸单泛素化（Monoubiquitination of histone H2B at lysine 120,H2Bub1）在过表达TMEM196的细胞株中表达增加。敲减组蛋白H2B的E3泛素连接酶RNF20导致H2Bub1表达下降,可引起Wnt信号通路上游分子SFRP1、SFRP2、DKK1表达减少,active-β-catenin表达升高。挽救性实验显示敲减RNF20可逆转TMEM196对active-β-catenin的抑制作用,同时恢复TMEM196过表达细胞的增殖及迁移能力。结论在结直肠癌中,TMEM196启动子区域由于高甲基化水平而导致其表达的降低或缺失。TMEM196在结直肠癌中发挥着抑癌作用,其机制主要是通过与组蛋白H2B相互作用引起H2Bub1增加,从而导致SFRP1、SFRP2、DKK1表达增加,进而抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。