前言：阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是一种发生于老年期或老年前期的慢性进行性神经退行性疾病,该疾病是以记忆力逐渐减退、认知障碍为突出表现,同时伴有精神行为异常、人格障碍等临床症状。AD的主要病理特征是脑内淀粉样蛋白沉积形成的老年斑(senile plaque,SP)和神经元内出现神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。NFTs是神经元内tau蛋白的过度磷酸化所致。老年斑的核心成分是一种由39～43个氨基酸残基构成的小神经肽—Aβ(β-amyloidpeptide),Aβ是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的裂解产物。脑内APP代谢有两条途径,一条是非Aβ生成途径,另一条是Aβ生成途径。非Aβ生成途径是α-分泌酶在α位点将APP水解成sAPPα和C83两个片段,C83接着被γ-分泌酶生成P3片段,不形成Aβ;另一条途径是APP被β-和γ-分泌酶连续裂解从而产生sAPPβ和Aβ。　　 胰岛素是由胰岛B细胞分泌的一种蛋白质类激素,其主要功能是降低血糖。近年来的研究发现脑内存在胰岛素和胰岛素受体(insulin receptor,IR)。脑内的胰岛素可以由外周血中胰岛素通过血脑屏障入脑,同时脑内的部分神经元也能够合成和分泌胰岛素。脑内胰岛素在血糖的调节、食物的摄入和体重的调节等过程中都发挥着重要的作用。胰岛素可以通过胰岛素信号转导通路影响认知功能。胰岛素及胰岛素信号通路调节的异常在AD发病和进展中起重要作用。流行病学资料显示,与正常人群相比,AD患者脑脊液中胰岛素水平明显下降,并伴有脑内胰岛素信号转导通路障碍;伴有胰岛素水平降低的AD患者更容易出现认知功能异常。向AD转基因鼠脑内注射链脲佐菌素(streptozotozin,STZ),可影响脑内胰岛素受体功能,导致AD症状加重和渐进性认知功能损害,再向实验鼠脑内注射胰岛素后,动物的认知功能明显恢复。采用经鼻腔胰岛素治疗方法,能改善早期AD及遗忘型轻度认知功能障碍患者的认知功能。更有趣的是,一些临床研究发现,对于糖尿病患者如果早期进行胰岛素治疗,发展为AD的风险会大大降低。另外,有研究发现STZ诱导的胰岛素缺乏可以增高小鼠脑内Aβ和磷酸化tau蛋白的表达,表明胰岛素缺乏参与Aβ的沉积和tau蛋白的异常磷酸化。但目前关于胰岛素缺乏影响AD发病的机制研究尚不十分清楚。　　 为了验证胰岛素缺乏在AD发病中可能的作用及机制,本实验选用APP/PS1转基因AD小鼠腹腔内注射STZ,应用行为学、形态学和分子生物学等手段,探讨胰岛素缺乏影响AD发病的证据及机制。同时采用过表达人APPsw基因的SH-SY5Y细胞,体外给予不同浓度的胰岛素,观察APP代谢和磷酸化tau蛋白的表达,进一步探讨胰岛素缺乏在AD发病中的作用。本项目的实施有望将胰岛素通路作为预防和治疗AD的新靶点,为有效的延缓或阻抑Aβ沉积和tau蛋白异常磷酸化奠定实验基础。　　 方法：　　 1、胰岛素缺乏对APP/PS1转基因小鼠脑内神经病理改变和认知功能影响及其机制的研究采用3月龄APP/PS1转基因小鼠,腹腔内注射STZ,诱导产生胰岛素缺乏的AD小鼠动物模型。应用Morris水迷宫检测AD小鼠的行为学变化;应用免疫组织化学技术检测AD小鼠脑组织老年斑的分布;应用PCR技术检测AD小鼠脑内APP mRNA的表达;应用ELISA对AD小鼠脑内Aβ含量进行定量分析;应用Western blotting技术检测AD小鼠脑内tau蛋白的磷酸化、APP代谢及胰岛素信号转导系统相关蛋白的表达。　　 2、胰岛素对高表达人APPsw的SH-SY5Y细胞内APP代谢及tau蛋白磷酸化的影响及其机制的研究采用高表达人APPsw的SH-SY5Y细胞,观察胰岛素对APP代谢的影响及机制研究。应用Westem blotting技术检测APPsw细胞内tau蛋白的磷酸化、APP代谢及胰岛素信号转导系统相关蛋白的表达;应用免疫荧光双标与共聚焦激光扫描显微镜检测APPsw细胞内p-GSK-3和Aβ及p-tau的共表达。　　 结果：　　 一、胰岛素缺乏对APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积、tau蛋白磷酸化及认知功能的影响　　 1、胰岛素缺乏对APP/PS1转基因小鼠体重、血糖和胰岛素含量的影响与正常对照组AD小鼠相比,STZ诱导的胰岛素缺乏导致AD小鼠血糖升高、体重下降及胰岛素水平下降。　　 2、胰岛素缺乏对APP/PS1转基因小鼠脑内APP裂解酶及其裂解产物蛋白表达的影响Western blotting结果显示:STZ诱导的胰岛素缺乏使AD小鼠脑内APP695蛋白水平明显增高;STZ组BACE1、sAPPβ、CTFs蛋白表达明显增多,而sAPPα表达下降。　　 3、胰岛素缺乏对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ及老年斑的影响免疫组化和ELISA结果显示:STZ诱导的胰岛素缺乏使AD小鼠大脑皮层、海马的老年斑块的数量和体积明显增多;STZ组Aβ1-42含量明显增加。　　 4、胰岛素缺乏对APP/PS1转基因小鼠脑内tau蛋白磷酸化的影响免疫组化和Western blotting结果显示:STZ诱导的胰岛素缺乏使AD小鼠脑内Thr231和Ser396位点上的tau蛋白磷酸化表达水平增高。　　 5、胰岛素缺乏对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力的影响Morris水迷宫结果显示:STZ诱导的胰岛素缺乏使AD小鼠的学习记忆能力和空间探索能力均显著降低。　　 二、胰岛素缺乏加剧APP/PS1小鼠脑内神经病理改变的分子生物学机制　　 1、胰岛素缺乏对APP/PS1转基因小鼠脑内胰岛素受体(IR)磷酸化的影响Western blotting结果显示:STZ诱导的胰岛素缺乏使AD小鼠脑内p-IR/IR比值明显下降。　　 2、胰岛素缺乏对APP/PS1转基因小鼠脑内GSK-3蛋白活性的影响Western blotting结果显示:STZ诱导的胰岛素缺乏使AD小鼠脑内p-GSK-3α/GSK-3α和p-GSK-3β/GSK-3β的比值明显下降。　　 3、胰岛素缺乏对APP/PS1转基因小鼠脑内MAPK蛋白活性的影响Western blotting结果显示:STZ诱导的胰岛素缺乏使AD小鼠脑内p-JNK1/JNK1和p-JNK2/JNK2的比值明显增高,而p-ERK/ERK和p-P38/P38的比值没有明显变化。　　 三、胰岛素对转染APPsw细胞内APP代谢及tau蛋白磷酸化的影响　　 1、胰岛素对APPsw细胞内GSK-3和JNK蛋白活性的影响Western blotting结果显示:不同浓度胰岛素使APPsw细胞p-GSK-3α/GSK-3α和p-GSK-3β/GSK-3β的比值逐渐增高;而胰岛素对P-JNK/JNK比值没有明显影响。　　 2、胰岛素对APPsw细胞内APP裂解产物蛋白表达的影响Western blotting和免疫荧光双标结果显示:100 nM和1000 nM的胰岛素使APPsw细胞内sAPPα蛋白表达明显增多,CTFs蛋白表达下降。Ap和p-GSK-3主要分布于细胞质中,而且在APPsw细胞中二者的表达有一定关系。　　 3、胰岛素对APPsw细胞内tau蛋白磷酸化的影响Western blotting结果显示:1000 nM的胰岛素使APPsw细胞内Thr231和Ser396位点上的tau蛋白磷酸化表达水平降低。P-tau和p-GSK-3主要分布于细胞质中,而且在APPsw细胞中二者的表达有一定关系。　　 结论：　　 1、STZ诱导的胰岛素缺乏可加剧APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ沉积、tau蛋白异常磷酸化及认知功能损伤。　　 2、STZ诱导的胰岛素缺乏可减弱APP/PS1转基因小鼠脑内胰岛素受体的蛋白活性,从而通过胰岛素信号转导途径使GSK-3和JNK蛋白活性增高。　　 3、胰岛素通过抑制GSK-3蛋白活性使APP向非Aβ生成途径代谢增加,tau蛋白磷酸化减少。