【摘 要】
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研究救必应抑菌部位的化学成分及其对多重耐药性大肠杆菌杆菌蛋白质组的影响,为救必应物质基础研究、生物活性研究及临床应用提供参考依据。采用二倍微量稀释法和PCR法检测实验室保存大肠杆菌的药物敏感性和耐药基因;用不同浓度乙醇溶液提取救必应总成分,运用溶剂萃取法、大孔吸附树脂色谱分析法结合抑菌性试验来确定救必应抑菌部位并得出其MIC,并以抑菌部位的1/2MIC联合抗生素诱导大肠杆菌进行传代培养,然后用微量
【基金项目】
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国家自然基金（项目批准号31460675）；
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研究救必应抑菌部位的化学成分及其对多重耐药性大肠杆菌杆菌蛋白质组的影响,为救必应物质基础研究、生物活性研究及临床应用提供参考依据。采用二倍微量稀释法和PCR法检测实验室保存大肠杆菌的药物敏感性和耐药基因;用不同浓度乙醇溶液提取救必应总成分,运用溶剂萃取法、大孔吸附树脂色谱分析法结合抑菌性试验来确定救必应抑菌部位并得出其MIC,并以抑菌部位的1/2MIC联合抗生素诱导大肠杆菌进行传代培养,然后用微量棋盘稀释法测定抑菌部位与抗生素联合作用后的部分抑菌浓度指数（FICI）;运用MCI、Sephadex LH-20、ODS C-18、Toyopearl HW-40F、Toyopearl Butyl-650C、Diaion HP20SS等分离柱及半制备液相色谱仪对救必应抑菌部位进行化学成分分离,根据所分化合物的理化性质和波谱数据对化合物的结构进行鉴定;运用差异蛋白组学法分析该抑菌部位对多重耐药性大肠杆菌蛋白质组的影响。主要试验结果如下:1、受试大肠杆菌对除美罗培南和阿米卡星之外的受试抗生素都耐药,且含有CTX-M耐药基因。2、用不同浓度乙醇溶液提取救必应总成分后,运用溶剂萃取法将其分为石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层,结合抑菌性试验发现只有水层具有抑制多重耐药性大肠杆菌的作用,又运用大孔吸附树脂色谱分析法将水层分为Fr1、Fr2、Fr3、Fr4四个流份,分别作用于大肠杆菌后发现只有Fr3具有抑菌效果。3、Fr3联合抗生素对多重耐药性大肠杆菌的传代培养后,痢菌净、克林沙星、磷霉素、阿莫西林、加替沙星、粘杆菌素、头孢噻肟钠、氟苯尼考、利福平的MIC降低了4倍及4倍以上,阿奇霉素的MIC降低了2倍,磺胺间甲氧嘧啶钠、林可霉素、头孢他啶、头孢噻呋钠和头孢曲松钠的MIC没有降低,还保持在原来水平,但环丙沙星的MIC反而增大。可见,Fr3可增强超过一半受试抗生素的抑菌效果且和抗生素联合作用于大肠杆菌时能降低部分抗生素的MIC。Fr3与克林沙星、粘杆菌素、加替沙星、头孢噻肟钠、氟苯尼考配伍后的FICI≤0.500;与痢菌净、磷霉素、阿莫西林、头孢噻呋钠、环丙沙星、利福平、阿奇霉素配伍后的0.5＜FICI≤1;与磺胺间甲氧嘧啶钠、林可霉素、头孢他啶、头孢曲松钠配伍后的FICI大于1。依据FICI的判定标准可知,Fr3与克林沙星、粘杆菌素、加替沙星、头孢噻肟钠、氟苯尼考配伍后呈协同效应,与痢菌净、磷霉素、阿莫西林、头孢噻呋钠、环丙沙星、利福平、阿奇霉素配伍后呈相加效应,与磺胺间甲氧嘧啶钠、林可霉素、头孢他啶、头孢曲松钠配伍则呈无关或拮抗效应。4、根据化合物的理化性质及其波谱数据共解析鉴定出11个化合物,分别为Silphioside B、2β-hydroxyoleanolic acid、竹节参皂苷Ⅳa甲酯、Eclalbasaponins I、Pedunculoside、Lucyoside C、28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid、3-O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-glucopyranoside、23-O-ethyloleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranoside、Chikusetsusaponin V Methyl Ester、3-O-β-D-glucopyranosyl（6→1）-β-D-glucopyranosyl-olean acid、（25R）-spirostane-1,3β,5β-triol-3-O-β-D-glucopyranoside,除（25R）-spirostane-1β,3β,5β-triol-3-O-β-D-glucopyranoside外,其他均为三萜类化合物。5、运用差异蛋白质组学法分析出救必应抑菌部位作用后的多重耐药性大肠杆菌蛋白质组的物质代谢通路和能量代谢通路上多种酶和蛋白表达下调。救必应抑菌部位和抗生素配伍后能增强大部分受试抗生素对多重耐药大肠杆菌的抑制效果,呈现协同或相加作用;从救必应抑菌部位分离得到10个三萜类化合物和一个甾体类化合物。多重耐药性大肠杆菌蛋白质组的物质代谢通路和能量代谢通路上多种酶和蛋白的表达下调可能是救必应的Fr3部位发挥抑菌作用的机制。
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