论文部分内容阅读
从成年健康肉兔的盲肠中筛选出对大肠杆菌(Escherichiacoli)等腹泻致病菌有较强抑制作用的抗腹泻芽孢杆菌,初步探讨其饲喂效果。以大肠杆菌、沙门氏菌和痢疾杆菌为指示菌进行初筛和复筛,选择抑制大肠杆菌活性较强的菌株;然后考察菌株对胆酸盐、胃肠道环境和高温环境的耐受性,考察菌株对抗生素的敏感性,评价其安全性;经过形态观察、生理生化试验和16SrDNA全序列分析鉴定菌株的种属。从健康肉兔的盲肠中筛选到能抑制大肠杆菌、沙门氏菌和痢疾杆菌等致腹泻病原菌的菌株Tu-569,经过鉴定其为Bacillusvelezensis,该菌株具有良好的温度耐受性,耐受0.4％胆酸盐,在胃肠道环境中能够正常生长繁殖,对中剂量的硫酸链霉素、土霉素、硫酸庆大霉素敏感,对中剂量的二甲氧苄啶、呋喃唑酮和磺胺脒耐受,且对幼兔安全,具有作为饲料添加剂饲喂幼兔的潜力。
对影响Tu-569菌株产抗菌物质的碳源、氮源、无机盐进行单因素试验以选择合适的种类,通过正交试验确定培养基组成;对影响Tu-569菌株产抗菌物质的发酵条件如温度、装瓶量、摇床转速、接种量、发酵时间进行正交试验,以确定该菌株产抗菌物质的最适条件。最佳的产抗菌物质的发酵培养基组成和发酵条件为培养基组成为1.5%可溶性淀粉、2.0%蛋白胨、0.07%MnSO4·H2O、0.05%MgSO4·7H2O,发酵时间为24h,装瓶量为50mL/250mL,接种量为2%,pH值为5.0。在该条件下,BacillusvelezensisTu-569菌株产抑菌多肽的能力显著提高,抑菌圈面积为322mm2,抑菌圈面积为未优化前的2.1倍。
BacillusvelezensisTu-569菌株胞外产抑菌物为分子量在3.5-8kD之间的多肽类,可被饱和度60%的硫酸铵盐析;该抗菌肽热稳定性较好,但可被蛋白酶降解;采用正丁醇萃取该抗菌肽不会降低其活性;其活性可被Mn2+离子增强,但在强酸(pH3)强碱(pH11)环境中会大幅度降低;当存在表面活性剂和β-巯基乙醇时,抗菌肽抑菌活性完全丧失。每1mg粗蛋白中含有的抗菌肽抑制大肠杆菌的能力相当于2μg硫酸庆大霉素、10μg硫酸链霉素或50μg土霉素:该抗菌肽性质稳定,具有较高的抗菌活性,在畜牧业、养殖业、食品等领域中有一定的应用价值。
对发酵液离心得到的上清液进行60%硫酸铵盐析,透析后冻干;通过DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析,改变影响分离效果的缓冲体系pH,对抗菌肽进行初步的分离纯化,结合SDS-PAGE等方法,对具有较强抑菌活性的组分进行纯度分析。结果表明,采用pH7.2的缓冲体系,可获得对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌具有较强抑制作用的洗脱峰3,结合TricineSDS-PAGE证实,洗脱峰3由相对分子质量约7.8kDa的主要成分和相对分子质量高于20.1kDa的次要成分组成。对Tu-569菌株产抗菌多肽分离纯化方法的初步探索为抗菌肽的纯化及结构测定奠定了基础,有利于其抑菌机制研究的开展。
将BacillusvelezensisTu-569菌株发酵液按不同比例拌料饲喂幼兔,进行小规模饲喂试验,检测生长性能指标、腹泻率及死淘率;分别于第7d、第14d、第21d和第28d取新鲜的粪便,测定粪便中的纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等多种消化酶活力;用传统微生物方法通过不同的选择性培养基检测粪便中芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和大肠杆菌数量,同时提取粪便中的总DNA通过ERIC-PCR做出肠道菌落多态性指纹图谱,用Quantityone4.6.2软件对图谱进行分析计算粪便中菌群的多样性指数;饲喂28d后,耳缘静脉取血,检测血常规指标;对幼兔进行解剖,取其心、肝、脾、胃、肾和胸腺,通过重量、颜色和质地的变化判断其是否健康。结果表明,不同组间的兔子的耳长、耳宽、体长、胸围没有差异;添加15mL/100g的Tu-569菌液量,幼兔采食量与对照组幼兔没有差异,但此时具有最低的耗料增重比和最大的饲料转化率。添加15mL/100g或25mL/100g的Tu-569菌液可有效预防腹泻,且不会导致幼兔死亡。添加Tu-569菌液会使白细胞、红细胞、血红细胞、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比等指标发生显著差异,其余各指标无显著差异。添加15mL/100g的Tu-569菌液会显著增加脾重、胸腺重,对幼兔免疫机能产生一定影响。添加Tu-569菌液可缩短达到菌群平衡所需的时间,提高菌群平衡时芽孢杆菌、酵母菌、乳酸杆菌的数量,减少并维持较低水平的大肠杆菌。采用15mL/100g可使幼兔肠道内较早的呈现微生物菌群多样化。添加15mL/100g的Tu-569菌液能够提高幼兔肠道内的各种消化酶活力,促进营养物质的消化吸收。上述研究表明,Tu-569菌株具有良好的应用潜力,可制备成菌剂用于防治幼兔腹泻及提高幼兔生产性能。