研究背景与目的:原发性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在恶性肿瘤中居第六位,死亡率居肿瘤相关死亡的第三位(WHO GLOBOCAN项目2012年数据),其中肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占原发性肝癌的80%~90%。随着科技的进步,HCC早期诊断与治疗取得了巨大的进展,但是患者5年生存率也只有17%~53%,复发率高达70%。寻找HCC早期诊断标志物和潜在的治疗靶标是领域内研究的重要热点之一。目前已知的HCC标志分子可分为组织标志物与血清标志物两大类,组织标志物主要包括GPC3、HSP70、TAG72、Ki-67、Hep Par1、HERC5等。血清标志物主要有AFP、AFP-L3、GP73、APO-J、DKK-1、HCR2、Midkine、脱-γ-羧基凝血酶原、GPC3、α-1-岩藻糖苷酶、HGF、NGF、VEGF、TGF-β、EGFR、Wnt、促血管生成素-1/2、NOTCH等。目前只有血清标志物AFP应用于HCC临床辅助诊断,并且约1/3 HCC患者血清AFP阴性。因此,进一步鉴定参与HCC发生发展的标志分子,不仅有助于理解HCC发生发展的分子机制,还有助于发现具有HCC早期诊断和生物治疗潜在的新靶标。本课题组前期研究发现多个HCC相关新分子,本文选择在HCC中差异表达的RAI16和SNORD113-1进行深入研究,以阐明它们在HCC发生发展中的作用及机制。一、RAI16对HCC发生发展促进作用的机制研究RAI16(Retinoic acid-induced protein 16,维甲酸诱导蛋白16,又称FAM160B2)属于维甲酸诱导蛋白质(Retinoic acid-induced protein,RAI)家族,大小82k Da。RAI在人、大鼠、小鼠、兔子和斑马鱼中高度保守,可调节多种疾病的发生发展。RAI16是一个相对较新的蛋白,其结构与功能鲜有报道。课题组前期研究发现,RAI16可作为mi R-483-5p的靶标分子,可促进HCC肿瘤的发生,可作为HCC基因治疗的潜在靶标和HCC诊断的分子标志物,过表达还具有抗凋亡作用,但其促进HCC发生和抗凋亡作用的机制并不清楚。本文旨在探讨RAI16促进HCC发生和介导抗凋亡的作用机制。研究方法:1、利用蛋白质组学(免疫共沉淀、串联质谱分析)分析与RAI16相互作用的蛋白。2、分别构建不同长度的RAI16、PKA-RIIα、HSP70、14-3-3θ表达质粒,利用mapping study以及免疫共沉淀技术检测RAI16与PKA-RIIα、HSP70、14-3-3θ之间直接作用的序列位置。3、体外纯化RAI16、PKA-RIIα蛋白,利用ELISA实验以及多肽抑制剂s Ht31验证RAI16与PKA-RIIα之间的相互作用。4、利用Scansite Motif Scanner预测RAI16与HSP70的磷酸化位点。5、利用单氨基酸突变、免疫共沉淀、Western Blotting、磷酸化分析、放射自显影等技术检测HSP70以及RAI16的磷酸化。6、利用流式细胞术检测细胞凋亡百分比。研究结果:1、外源及内源RAI16均可与PKA-RIIα互作;RAI16 Aa352-370可与PKA-RIIαD/D结构域结合,并可形成两性α螺旋,是AKB结构域。RAI16是一个新型的AKAP(A-kinase anchoring protein,A型激酶锚定蛋白)。2、外源及内源RAI16均可与HSP70发生互作;RAI16中部的Aa251-500可与HSP70 C端Aa441-641结合;并且RAI16可介导PKA对HSP70的第486位丝氨酸的磷酸化,促进HSP70的抗凋亡作用。RAI16 Aa251-500片段存在AKAP靶向结构域。3、外源及内源的RAI16均可与14-3-3θ发生相互作用;RAI16的Aa251-500可与14-3-3θ的Aa81-160结合。RAI16 Aa251-500片段存在AKAP与其它信号分子结合区域。4、RAI16的第325位丝氨酸可被PKA磷酸化;并且RAI16自身磷酸化促进其与14-3-3θ互作。RAI16与14-3-3θ的相互作用依赖RAI16/PKA-RIIα复合物的形成。5、RAI16与14-3-3θ结合后,可抑制RAI16介导的PKA对HSP70的磷酸化。结论:本研究首次发现RAI16可作为支架蛋白AKAP将PKA定位至特定的亚细胞区室,实现对特异性底物的磷酸化,调控信号转导。RAI16可介导PKA磷酸化HSP70,同时RAI16自身也会被PKA磷酸化,进而促进其对14-3-3θ的招募,反过来,抑制RAI16介导的PKA对HSP70的磷酸化。所以RAI16可能通过参与HSP70相关的抗凋亡信号途径发挥重要作用。进一步解释了RAI16在HCC中介导抗凋亡的作用机制。二、SNORD113-1对HCC发生发展的抑制作用及机制研究Sno RNAs(small nucleolar RNAs)是一类长60~300个核苷酸的小分子非编码RNA,其主要存在于核仁,作为guide RNA调节核糖体RNA以及一些剪切体RNA的转录后修饰。SNORD113-1(Small nucleolar RNA 113-1)是长70个核苷酸的sno RNA分子,结构上属于C/D box sno RNA,基因位于14号染色体的Dlk1-Dio3区,其在临床HCC肿瘤中的表达水平与作用,尚未见报道。研究方法:1、收集临床肝细胞癌患者的肿瘤与癌旁组织样本,利用micro-array和q RT-PCR技术检测SNORD113-1在组织样本中的表达水平。2、根据提供样本的HCC患者临床病理信息,进行统计分析,研究SNORD113-1对HCC患者术后生存的预测价值以及与临床病理特征的相关性。3、利用双荧光素酶报告系统,分析SNORD113-1基因的启动子区域。4、利用亚硫酸钠测序技术检测SNORD113-1启动子区Cp G岛的甲基化水平。5、利用表达质粒与小干扰RNA,过表达或敲低SNORD113-1的表达水平,利用Cell Titer-Blue、克隆形成分析、细胞流式技术、Transwell迁移小室、Matrigel侵袭小室检测SNORD113-1对肝细胞癌细胞体外增殖、细胞周期、细胞凋亡、迁移与侵袭的影响。6、利用裸鼠皮下荷瘤模型,研究SNORD113-1对肝细胞癌细胞在体增殖的影响。7、利用癌症相关信号通路分析、Western Blotting技术,研究SNORD113-1对MAPK/ERK以及TGF-β等信号通路的影响。研究结果:1、在112对HCC肿瘤与癌旁组织样本中,SNORD113-1在77.6%的肿瘤组织中明显下调。2、肿瘤组织中SNORD113-1低表达的HCC患者,中位生存期(68.4个月)明显低于SNORD113-1高表达的HCC患者(99.8个月)。SNORD113-1低表达与HCC患者的不良预后相关。3、SNORD113-1基因位于14号染色体,软件预测以及荧光素酶报告系统均显示14号染色体的F1(82370922~82371234)区具有很强的启动子活性,可能是SNORD113-1的启动子区。4、HCC肿瘤组织的F1片段中,44.4%的Cp G岛发生了超甲基化,明显高于癌旁组织。SNORD113-1在HCC组织中低表达是由其启动子区域的超甲基化引起的。5、过表达SNORD113-1可抑制肝细胞癌细胞的增殖,影响细胞周期,使更多的细胞停留在细胞周期的S期;敲低SNORD113-1可促进肝细胞癌细胞的增殖,使更多的细胞在细胞周期的G2-M期。对细胞凋亡、迁移和侵袭无明显影响。6、裸鼠荷瘤实验证明,敲低SNORD113-1的Hep G2细胞产生的瘤体显著大于对照组;过表达SNORD113-1的Hep G2细胞产生的瘤体显著小于对照组。7、敲低SNORD113-1可促进MAPK/ERK信号通路中MEK、ERK1/2以及TGF-β信号通路中SMAD2/3的磷酸化水平;过表达SNORD113-1可显著抑制MAPK/ERK信号通路中MEK、ERK1/2以及TGF-β信号通路中SMAD2/3的磷酸化水平。结论:本研究发现,HCC时SNORD113-1启动子区Cp G岛发生的超甲基化,致SNORD113-1表达下调,SNORD113-1的低表达可促进细胞增殖,从而促进肝细胞癌的发生和发展。机制研究表明,SNORD113-1对HCC肿瘤的抑制作用是通过调控MAPK/ERK信号通路中MEK、ERK1/2以及TGF-β信号通路中SMAD2/3的磷酸化水平实现的。三、小结本研究通过人类转录本分析,发现了RAI16与SNORD113-1在HCC中差异表达,进一步的功能与机制研究发现两者对HCC分别具有促进和抑制作用。(1)首次发现,RAI16对HCC的促进作用是通过其作为支架蛋白AKAP,将PKA定位至特定的亚细胞区室,磷酸化HSP70实现的。并且,RAI16可同时与PKA、14-3-3θ结合,形成多分子复合物,协同调节HSP70的磷酸化,实现对细胞内信号通路的精确调控。(2)首次发现SNORD113-1对HCC具有抑制作用。证明SNORD113-1对HCC的抑制作用是通过调控MAPK/ERK信号通路中MEK、ERK1/2以及TGF-β信号通路中SMAD2/3的磷酸化实现的。本文通过对RAI16在HCC中抗凋亡机制的研究,以及SNORD113-1对HCC恶性生物学行为的调控和机制的研究,进一步加深了对HCC多阶段发展、多基因参与的理解,并为鉴定HCC早期诊断的潜在标志物及疗效与预后判断提供了潜在靶标。