第一章绪论 糖尿病性勃起功能障碍发病机制十分复杂，目前认为主要有神经与神经递质、血管、代谢以及内分泌等因素共同导致，而其中神经与神经递质因素起了关键的作用．神经营养因子是一个蛋白家族，主要包括神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、神经营养因子—4/5(Neurotrophin-4/5，NT—4/5，以下简称NT—4)等。它们在各类神经的发育、分化和再生过程中都发挥着重要作用。本论文旨在通过一系列的研究，来探讨NT在DED的发病机制中的作用，并尝试使用NT来治疗DED动物以及疗效的观察。本论文正文分为五个部分，下面分别陈述． 第二章糖尿病大鼠模型的建立目的分期分批建立用于整个研究的糖尿病大鼠模型。 方法:清洁级Sprague—Dawley(SD)雄性大鼠(第一次建模：一共25只，200-250g，取15只造模；第二次建模：50只，200-250g，取44只造模；第三次：30只，280-320g，取20只造模)。链脲唑菌素(Streptozotocin，STZ)65mg/kg一次性腹腔注射法制作糖尿病模型。模型建立后72小时，尾静脉取血，快速血糖测定仪测定血糖，血糖＞16.67mmol/L入选，认为建模成功。第一次建模成功后在清洁级环境中饲养8周。测定建模前及饲养8周后大鼠体重及血糖值。(其它批次建模因建模后有试验步骤干预，相关数据放在各自相应部分中再报告。) 结果1、STZ注射后第二天起，建模成功大鼠逐渐出现多饮多食多尿，其中第一次建模15只，成功11只；第二次建模44只，成功37只；第三次建模20只，成功16只。饲养八周后，糖尿病大鼠出现明显的消瘦，毛发无光泽。 2、第一次建模，糖尿病组体重(179.0±30.4)明显低于正常对照组(365.8±47.3)，血糖(22.34±6.14 mmol/L)明显高于正常对照组(6.51±2.45 mmol/L)。 小结RTZ一次性腹腔注射可以成功诱导出糖尿病大鼠模型． 第三章四种神经营养因子在糖尿病大鼠阴茎海绵体表达的差异 目的:研究四种神经营养因子(NGF、BDNF、NT-3，NT—4)在正常和糖尿病大鼠阴茎海绵体表达的差异，探讨四种神经营养因子在糖尿病性ED的发病机制中的作用． 方法:第一次建模大鼠，正常对照大鼠10只，糖尿病大鼠11只．在清洁级环境中饲养8周后，测定各组大鼠电刺激勃起神经下阴茎海绵体内压(Intracavernous pressure，ICP)值。处死大鼠后，取阴茎海绵体中后段组织，分为两段，一部分用于免疫组化(检测NGF、BDNF)，另一部分用于蛋白免疫印迹测定(Western Blot)(检测NGF、BDNF、NT-3、NT—4)． 结果 1、糖尿病组大鼠ICP值明显低于正常对照组． 2、糖尿病组大鼠阴茎海绵体NGF阳性染色神经纤维明显多于正常对照组；而糖尿病组大鼠阴茎海绵体BDNF阳性染色神经纤维明显少于正常对照组。 3、与正常对照组相比，糖尿病组大鼠阴茎海绵体NGF、NT-3、NT—4蛋白表达明显增加；而BDNF蛋白表达明显减少． 小结 1、STZ诱导的糖尿病大鼠建模成功后，饲养8周后均存在一定程度的勃起功能障碍。 2、阴茎海绵体中存在NT—4蛋白的表述，发挥的具体作用不详． 3、糖尿病状态下，大鼠阴茎海绵体组织中NGF、NT-3、NT—4蛋白表达量增加，BDNF蛋白表达量减少． 4、神经营养因子的差异表达，可能与糖尿病性ED的发病机制有一定的关系。 第四章外源性NGF治疗糖尿病性勃起功能障碍大鼠 目的:尝试使用外源性NGF治疗DED大鼠并观察疗效，探讨NGF在糖尿病性ED的发病机制中的作用． 方法:第二次建模大鼠，正常对照组(C)大鼠6只，糖尿病生理盐水腹腔注射组(D)大鼠8只，糖尿病NGF腹腔注射组(D-NGF)大鼠8只，糖尿病胰岛素皮下注射组(D—I)大鼠6只，糖尿病NGF+胰岛素组(D-NGF+I)大鼠6只．给药饲养8周后，测定各组大鼠电刺激勃起神经下阴茎海绵体内压(Intracavernous pressure，ICP)值。处死大鼠后，取阴茎海绵体中后段组织，用于免疫组化(检测nNOS)。 结果:1、D组大鼠ICP值明显低于C组；而D-NGF、D—I、D-NGF+I组的ICP值均明显高于D组；其中D-NGF+I的ICP值最高。 2、D组大鼠阴茎海绵体nNOS阳性染色神经纤维明显少于C组；而D-NGF、D—I、D-NGF+I组的大鼠阴茎海绵体nNOS阳性染色神经纤维均明显高于D组；其中D-NGF+I组最高． 小结 1、NGF治疗DED大鼠，能明显改善其勃起功能． 2、NGF治疗DED大鼠，能明显增加阴茎海绵体nNOS神经纤维含量。 3、NGF和胰岛素协同治疗DED大鼠，有协同作用。 第五章神经生长因子基因腺病毒载体的构建 目的:构建带有神经生长因子(β-NGF)基因的重组腺病毒表达载体，用于后续NGF基因治疗DED大鼠的试验研究。 方法:根据SD大鼠β-NGF mRNA全长序列设计引物，采用Trizol法从脑组织中提取总RNA，RT—PCR扩增β-NGF基因编码区全长序列，并与T载体T/A克隆，在凝胶图像分析仪上分析，并经自动测序仪测序以验证所构建DNA片段的正确性．将β-NGF—T vector质粒酶切，将β-NGF cDNA接入穿梭载体Pshuttle—hrGFP，将β-NGF—P shuttle—hrGFP与pAdEasy-1 vector同源重组，重组质粒共转染DH-50α大肠杆菌，大量扩增、纯化及回收后，转染293-A细胞，大量扩增，超高速离心机氯化铯密度梯度离心纯化，鉴定，—80℃保存，供下一部分研究用。 结果:1、重组质粒β-NCF—T vector双酶切电泳后可见特异的酶切片段．2、DNA测序结果显示，重组载体上插入的β-NGF DNA片段与设计时NGFmRNA全长序列一致．3、重组质粒β-NC3F—P shuttle—hrGFP双酶切电泳后可见特异的酶切片段．4、β-NGF—hrGFP—pAdEasy重组病毒颗粒酶切电泳后可见特异的酶切片段．5、β-NOF—hrGFP—pAdEasy转染293-A细胞后可见明显绿色荧光。6、β-NGF—hrGFP—pAdEasy转染293-A细胞后可见明显细胞病变效益(CPE)．7、氯化铯密度梯度离心可见明显病毒层。 第六章 NGF转基因治疗糖尿病性勃起功能障碍大鼠 目的:尝试使用β-NGF—hrGFP—pAdEasy重组腺病毒载体治疗DED大鼠并观察疗效． 方法:第三次建模大鼠饲养4周后分组，正常对照组(N)大鼠10只，糖尿病hrGFP—pAdEasy空载体阴茎海绵体注射组(GFP)大鼠8只，糖尿病β-NGF—hrGFP—pAdEasy重组腺病毒载体阴茎海绵体注射组(NGF—GFP)大鼠8只．给药饲养4周后，测定各组大鼠电刺激勃起神经下阴茎海绵体内压(ICP)值．各组大鼠处死后，将阴茎海绵体中后段组织分为两部分，一部分用于荧光显微镜观察绿色荧光(检测绿色荧光蛋白)，另一部分用于Western Blot(检测β-NGF，NGF高亲和力受体trkA)． 结果:1、GFP组大鼠ICP值明显低于N组；而NGF—GFP组的ICP值明显高于GFP组．2、GFP、NGF—GFP组大鼠阴茎海绵体组织可见明显绿色荧光。3、NGF—GFP组大鼠阴茎海绵体NGF蛋白表达量明显高于正常组和GFP组，但正常组和GFP组之间无明显差异。4、GFP组大鼠阴茎海绵体trkA蛋白表达量轻度高于正常组，而NGF—GFP组明显高于其余两组。 小结 1、β-NGF—hrGFP—pAdEasy重组腺病毒载体能在大鼠阴茎海绵体组织中高效表达． 2、GFP作为报告基因，能在海绵体组织中正常表达并且方便观察，在男科基础研究中有良好的应用前景． 3、β-NGF—hrGFP—pAdEasy重组腺病毒载体治疗DED大鼠，能部分改善其勃起功能。 4、NGF基因治疗DED大鼠的机制可能与NGF过量表达后，增加NGF与高亲和力受体trkA的结合形成活性复合物有关． 全文结论： 1、STZ一次性腹腔注射可以成功诱导出糖尿病大鼠模型。 2、糖尿病状态下，大鼠阴茎海绵体组织中NGF、NT-3、NT—4蛋白表达量增加，BDNF蛋白表达量减少；神经营养因子的差异表达，可能与糖尿病性ED的发病机制有一定的关系。 3、外源性NGF治疗DED大鼠，通过增加阴茎海绵体nNOS神经纤维含量，明显改善其勃起功能．而且NGF和胰岛素协同治疗DED大鼠，有协同作用。 4、β-NGF—hrGFP—pAdEasy重组腺病毒载体治疗DED大鼠，能明显改善其勃起功能． 5、NGF基因治疗DED大鼠的机制可能与NGF过量表达后，增加NGF与高亲和力受体trkA的结合形成活性复合物有关．