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研究背景近年来，基因治疗取得长足的进展，全世界已有上千例基因治疗研究进入临床试验，治疗的范围已从遗传病领域扩展到癌症、心血管疾病、神经系统疾病、传染病（包括AIDS）等领域。然而，呈递基因药物的载体的局限性阻碍了基因治疗的发展。rAAV（Recombinant Adeno-associated Virus）基因药物载体这一后起之秀格外引人注目，腺相关病毒属于细小病毒家族，具有宿主范围广、非致病性、能长期稳定表达外源基因等优点，被认为是最有前景的基因治疗载体之一。一些临床研究的问题如血友病基因治疗中AAV2外壳启动了CD8+T细胞介导的免疫反应，对肝细胞产生细胞毒性，缺陷、帕金森病的临床试验被证明基本无效，对rAAV载体的表达效率提出了更高要求。一些治疗基因，在发挥抗肿瘤作用的同时，还可提高载体的表达效率。2009年Johnson等研究发现，siRNA介导的沉默机制使rAAV载体的表达效率最高可提高15倍和30倍。2011年Wallen等从5520个siRNA文库中筛选出50个能提高rAAV表达至8倍的siRNA。以上研究为本论文提供了良好的借鉴。miRNA是一类长约22nt的小片段RNA分子，能够在转录后水平调控基因表达。它的异常表达与肿瘤发生关系密切，尤其是在肺癌中的影响，引起强烈关注，并得到大量研究。研究目的本论文将探索miRNA在以rAAV作为载体的基因治疗中的作用，在小细胞肺癌细胞NCI-H446细胞系中高通量筛选miRNA文库以发现促进rAAV表达的miRNA序列并利用生物信息学软件对明星miRNA进行靶点和信号通路预测，探索其作用机理，为rAAV-miRNA的基因药物的研究打开一扇门。研究方法（1）细胞培养，建立NCI-H446细胞系；（2）脂质体转染法共转染EGFP siRNA和EGFP质粒以评估和建立良好的转染体系；（3）脂质体转染法转染包含近2000条序列的miRNA文库；（4）转染rAAV-GLUC病毒，以GLUC荧光表达量来衡量rAAV的表达水平；（5）用腔肠素（coelenterazine）配制工作液来检测GLUC荧光强度；（6） MTT法检测转染体系中细胞增殖及活力；（7）用稳健型Z评分，四分位法等统计学算法对筛选数据进行科学的统计和结果鉴定，挑选出可以提高rAAV转染效率的miRNA；（8）使用生物信息学软件如Targetscan，Pictar，DAVID等对筛选出的miRNA进行靶基因和信号通路预测，以进一步探究miRNA作用机理。研究结果（1）重复两次完成了近2000个miRNA序列文库的筛选，获得了信息量丰富的数据，并挑出了促进rAAV高表达的miRNA分子；（2）对初筛的miRNA进行生物学验证，证实了初筛的结果；（3）根据生物信息软件预测结果分析讨论了miRNA参与rAAV转染过程的可能机制。