论文部分内容阅读
目的：活性羰基类物质具有广泛的生物毒性,它们在衰老过程中的作用深受研究者们关注。许多研究显示间充质干细胞(MSC)的功能变化参与了衰老过程及相关疾病的发生。然而,羰基类物质对MSC的影响,目前所知甚少。本文研究了活性羰基化合物丙二醛(MDA)对小鼠骨髓MSC体外增殖、凋亡及分化的作用及其机制,为阐明生物衰老过程中的MSC羰基应激机制提供了实验证据；并观察了人参皂苷Rg1抗MSC羰基应激的药理活性,为人参皂苷用于MSC相关老年性疾病的治疗提供研究依据。方法：在不同浓度MDA的条件下,进行原代骨髓细胞体外培养,并检测MSC集落形成率。通过传代扩增培养,获得了MSC纯化细胞。对纯化的MSC进行常规、成骨诱导和成脂诱导。在诱导后,加入不同量的MDA,或先用人参皂苷Rg1预处理24h后再进行MDA处理。处理后的细胞进行如下检测：①MTT比色法测定细胞活力；②BrdU掺入试验测定DNA合成速率；③流式细胞术、Hochest33258染色和TUNEL法检测细胞凋亡率；④茜素红染色和Von Kossa’s染色观察钙结节形成；⑤磷酸对硝基苯法测定碱性磷酸酶活性；⑥油红O染色观察细胞内脂滴形成；⑦Q-RT-PCR检测ALP、Runx2/Cbfal、 PPARγ2、bcl-2、Bax、caspase-3mRNA的表达水平,⑧Western blotting检测p38MAPK、JNK的表达和磷酸化；⑨免疫荧光标记+激光共聚焦显微术观察细胞内JNK分布。结果：(1)MDA对MSCs的增殖抑制作用在MDA浓度为0.01～1mmol/L的培养体系中,随着MDA浓度的增加,原代骨髓细胞的MSC集落产率、MSC传代扩增细胞的MTT吸光值及BrdU掺入阳性细胞百分率均逐渐降低,呈现明显的量效关系；0.1mmol/L和1.0mmol/L浓度组与对照组比,这些指标在组间均有显著性差异。(2)MDA对MSCs的凋亡诱导作用随着MDA浓度在0.01-1mmol/L范围内增加,MSC传代扩增细胞的凋亡率增高、bcl-2mRNA表达水平降低、而Bax mRNA和caspase-3mRNA表达水平均增加,且各指标呈现明显的量效关系。0.1mmol/L和1.0mmol/L浓度MDA组与对照组相比,这些指标在组间均有显著性差异。(3)MDA对MSCs的抑制成骨和促进成脂分化作用在成骨诱导培养一定时间后,与成骨诱导液对照组相比,0.1mmol/L和1.0mmol/L浓度MDA组MSC传代扩增细胞的钙结节形成率、碱性磷酸酶活性、ALP和Runx2/Cbfal mRNA表达水平均下降。在成脂诱导培养一定时间后,与成脂诱导液对照组相比,0.1mmol/L和1.0mmol/L浓度MDA组MSC传代扩增细胞的脂滴数量显著增加,PPARy2mRNA表达水平也显著增高。0.01mmol/L浓度MDA组与成脂诱导液对照组相比,细胞内脂滴数量和mRNA表达水平有所增加,但无显著性差异。(4)MDA对MSC的p38MAPK和JNK信号通路的影响在MSC传代细胞受0.1mmol/L MDA作用的早期,p38MAPK和JNK蛋白表达水平和磷酸化程度均增高,随着作用时间延长,其表达水平和磷酸化程度均降低。激光共聚焦显微观察显示,JNK蛋白由胞浆明显转位于胞核内。(5)人参皂苷Rg1的抗MSCs羰基应激作用与MDA(终浓度为0.1mmol/L)对照组比,在提前24h加入人参皂苷Rg1(终浓度为10mg/L、50mg/L或100mg/L)的小鼠骨髓细胞原代培养体系中,MSC集落产率增高；50mg/L和100mg/L浓度组集落产率的增高有显著性意义。与MDA(终浓度同上)对照组比,提前24h在MSC传代纯化细胞培养体系中加入人参皂苷Rg1(终浓度同上)的各组,MTT比色试验吸光值、BrdU掺入阳性细胞百分率、bcl-2mRNA和蛋白表达水平增高,而细胞凋亡率、Bax和caspase-3的mRNA和蛋白表达水平减低,并具有一定的量效关系。与MDA(终浓度同上)对照组比,提前24h在MSC传代纯化细胞成骨诱导培养体系中加入人参皂苷Rg1(终浓度同上)的各组,钙结节形成率增加,ALP活性增高,ALP mRNA和mRNA表达水平上调；在同法加入人参皂苷Rg1的成脂诱导培养各组,细胞内脂滴数减少,mRNA表达水平下调。这些成骨和成脂状况反映指标与人参皂苷Rg1之间有浓度-效应关系。结论：体外培养条件下,小鼠骨髓MSCs受到一定浓度MDA的作用,发生羰基应激,提示羰基化合物的MSC生物毒性作用参与衰老过程,并可能与骨质疏松症等MSC相关性老年性疾病的发生有关。对于MDA所致体外培养下MSCs的羰基应激,人参皂苷Rg1具有一定的细胞保护作用,这为人参及其有效成分用于MSC相关老年性疾病防治的进一步研究提供了实验证据。