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背景：Ⅲ型钠离子通道α亚基编码基因SCN3A的表达存在时空特异性，并受严格的调控。它主要在胚胎和新生期中枢神经系统中呈高表达，出生后明显减少。癫痫、精神发育迟滞、孤独症、脊髓损伤后产生的神经病理性疼痛等神经系统疾病与SCN3A基因表达异常有关。该基因的启动子及其转录调控元件的异常调控很可能是导致病理情况下Nav1.3表达增多的原因。c-Fos是一种真核生物早期基因表达调控的转录因子，在人及哺乳动物神经系统的发育过程中发挥重要作用。c-Fos对钠通道基因的表达调控迄今还未见报道。目的：本研究通过鉴定hSCN3A基因启动子和上游转录调控区域，以及通过生物信息学分析hSCN3A基因的转录调控元件，体外证实c-Fos调控元件的生理功能，以期进一步探讨SCN3A基因时空表达调控的分子机理及其与癫痫发生和发展的相关性。方法：本课题组前期已经成功构建hSCN3A基因启动子与荧光素酶报告基因pGL4.10的系列重组质粒，现采用5′端截短方法构建不同长度的hSCN3A基因启动子与荧光素酶报告基因pGL4.10的系列重组质粒，通过转染NGF诱导的PC12细胞后，根据双荧光报告系统测定的相对荧光素值，统计分析hSCN3A基因启动子和上游调控区域的相关功能。利用生物信息学分析hSCN3A基因转录起始点和上游序列的特征并预测与之相关的调控元件，选择预测的c-Fos调控元件进行功能研究。采用定点诱变的方法对c-Fos调控元件位点进行缺失突变，构建缺失突变后荧光素酶报告基因表达载体（PGL4-F1.1-cFos-del），分别转染PC12细胞和NGF诱导的PC12细胞后，根据双荧光报告系统测定的相对荧光素值，统计分析调控元件的功能。为研究转录因子与调控元件的结合，构建转录因子的表达质粒，并在编码转录因子序列前端插入编码V5标签蛋白的序列，采取Western Blot实验证明融合蛋白的表达。合成生物素标记的带有调控元件的DNA探针，采取凝胶阻滞的电泳迁移实验，分析探针与蛋白的结合情况。结果：1. hSCN3A基因最小功能启动子及其上游转录调控区的鉴定对hSCN3A基因启动子不同长度片段（F0.9、F0.7、F0.5、F0.3、F0.2、F0.1）的分析表明，F0.9和F0.7与F1.1比较，相对荧光素酶活性分别下降约30%和80%，这两个区域为正性调控区域，该区域可能存在正性调控元件；在转录起始点上游-548到+174bp区活性改变不明显,为最小功能启动子。2. hSCN3A基因启动子区潜在的转录调控元件使用软件预测hSCN3A基因启动子转录起始点上游的正性调控区域内的转录调控元件，发现了多个潜在的转录调控元件，同时我们选取预测的c-Fos转录调控元件进行后续的功能研究。3. hSCN3A基因启动子区c-Fos转录调控元件上调报告基因表达，且需要NGF参与通过对c-Fos转录调控元件敲除质粒的活性分析，在PC12细胞中，野生型质粒的活性与NGF诱导的PC12细胞相比较下降40%，而c-Fos del质粒无差异；在NGF诱导的PC12细胞中，c-Fos del质粒的活性与野生型质粒相比较下降50%，而在PC12细胞中c-Fos del质粒与野生型质粒活性无差异。结果表明，在PC12细胞中，只有在NGF诱导条件下，c-Fos元件才能显著性上调hSCN3A基因启动子活性。4. NGF上调PC12细胞内源Scn3a基因表达的影响使用RT-PCR和荧光定量PCR的方法对PC12细胞的内源Scn3a基因表达进行分析，RT-PCR结果显示，在NGF诱导情况下，PC12细胞的内源Scn3a基因PCR的条带浓度明显较无NGF时高，同时荧光定量PCR显示，在NGF诱导情况下，PC12细胞的内源Scn3a的转录本明显较无NGF时高，上述结果表明NGF能上调PC12细胞内源性Scn3a基因表达。5. c-Fos蛋白与转录调控元件不直接结合为研究c-Fos与调控元件是否直接结合，本研究首先构建V5-c-Fos融合表达载体，并采用Western Blot实验证明异源表达的融合蛋白V5-c-Fos是否被运至细胞核。采取凝胶阻滞的电泳迁移实验，观察V5-c-Fos蛋白与转录调控元件的DNA片段的结合，结果显示V5-c-Fos蛋白并未与调控元件直接结合。提示c-Fos蛋白可能以间接方式与转录调控元件结合。结论：本研究鉴定了人SCN3A基因的最小功能启动子及其上游调控区的功能，发现在转录起始点上-558到-549bp范围内存在一个有功能的c-Fos调控元件，该元件只有在NGF存在的情况下才具有增加SCN3A启动子活性的功能，提示c-Fos对SCN3A基因的表达调控需要NGF的参与。