研究背景和目的具文献报道,NCK1参与细胞骨架重构,并能增强细胞的运动迁移能力。鉴于肿瘤细胞的运动转移能力较强,我们猜想NCK1可能与肿瘤有关。本课题拟检测NCK1在结直肠癌中的表达与功能,探讨其在结直肠癌中异常表达以及功能影响的分子调控机制。研究方法采用qRT-PCR、western blot和免疫组化技术检测结直肠癌中NCK1的表达水平,并分析其表达情况与临床病理参数之间的关系;利用体外和体内功能实验检测NCK1稳定干扰和过表达后结直肠癌细胞转移及促血管生成能力的改变;利用Spearman correlation法对42对结直肠癌样本中STAT3和NCK1的基因表达水平进行相关性分析,通过双荧光素酶报告基因和ChIP实验验证STAT3是否能够结合并激活NCK1的启动子区域;在结直肠癌细胞中稳定上调或下调NCK1后,检测PAK1、ERK的蛋白水平及磷酸化情况,应用PAK1磷酸化抑制剂验证PAK1磷酸化对于NCK1激活ERK通路的必要性;应用免疫荧光共聚焦技术和Co-IP实验验证NCK1、PAK1和PYK2三者间的相关性,并在NCK1稳定上调细胞中沉默PYK2,探讨PYK2对于NCK1诱导PAK1磷酸化以及调控下游通路的关键性。最后,在STAT3过表达结直肠癌细胞中共转染NCK1干扰慢病毒,初步探讨STAT3-NCK1-PAK1-ERK线性结构在结直肠癌发生发展中的可能机制。研究结果相对于配对正常肠组织,结直肠癌组织中NCK1的表达水平显著上调,且表达水平与肿瘤浆膜浸润、淋巴结转移和TNM分期呈正相关关系,而与肿瘤分化程度呈负相关关系;稳定干扰NCK1后,结直肠癌细胞转移及促血管生成的能力显著减弱,而稳定过表达NCK1后,结果相反;在42对结直肠癌组织中,NCK1的基因表达水平与STAT3具有正相关性(r=0.739,P=0.000),STAT3能够靶向结合NCK1的启动子并促进NCK1的表达;过表达NCK1能有效诱导PAK1、ERK的磷酸化,应用PAK1磷酸化抑制剂后,NCK1诱导的PAK1、ERK磷酸化水平均被抑制,说明NCK1可能通过诱导PAK1磷酸化从而激活ERK通路;Co-IP实验结果证实NCK1、PYK2和PAK1三者间存在相互作用,在NCK1过表达细胞株中沉默PYK2,会有效削弱NCK1对PAK1磷酸化的诱导能力,说明PYK2的稳定性对于NCK1诱导PAK1磷酸化至关重要;过表达STAT3可明显上调PAK1、ERK的蛋白磷酸化水平,而共转染NCK1干扰慢病毒后,STAT3对PAK1、ERK磷酸化的诱导作用被部分削减。因此,STAT3-NCK1-PAK1-ERK可能作为线性轴参与结直肠癌转移及促血管生成的分子调控。结论NCK1在结直肠癌组织中表达增加,与结直肠癌恶性进程正相关。在STAT3的转录调控下,NCK1通过与PYK2共同作用于PAK1并诱导PAK1磷酸化从而激活ERK通路活性,最终体现在NCK1对结直肠癌转移和血管生成的促进作用。