目的阿尔茨海默病(Alzheimer s disease,AD)是一种以渐行性记忆减退、认知功能障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病。国内外学者虽做了大量研究,但到目前为止还没有找到有效的治疗方法。磷酸二酯酶4(Phosphodiesterase 4,PDE4)是体内特异性催环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水解的酶。有研究证实PDE4抑制剂如咯利普兰、罗氟普兰、GEBR-7b等具有改善AD的作用,但因PDE4抑制剂具有较强的致呕吐的副作用,这大大限制了其应用于临床。罗氟司特(Roflumilast,RFM)是PDE4的长效抑制剂,副作用小,是美国FDA批准用于治疗慢性阻塞性肺疾病药物。近年Vanmierlo等研究发现,罗氟司特在非致呕吐剂量下可改善小鼠的认知功能;Jabaris等则研究发现,罗氟司特对高血压诱导的认知功能下降也具有明显的改善作用。由此推测罗氟司特可能也具有潜在改善AD作用,但目前对于其详细作用和机制还未有详细报道。因此本课题拟以APP/PS1双转基因诱导AD模型,观察罗氟司特对AD小鼠认知功能、焦虑、抑郁等行为学的影响,并从PDE4/cAMP/PKA/CREB信号通路对罗氟司特抗AD作用机制进行研究,以期通过以PDE4为靶点为开发AD治疗药物提供理论依据。方法1、AD模型的建立及分组给药:选取APP/PS1双转基因雄性小鼠作为AD小鼠,与其具有相同遗传背景的C57BL/6J雄性小鼠作为对照小鼠进行试验。罗氟司特设置两个剂量组,低剂量组(5mg/kg)、高剂量组(10mg/kg),灌胃给药30天,每天一次给药。2、观察罗氟司特对小鼠行为学的影响:灌胃给药20天后进行以下行为学实验,行为学检测于灌胃给药2h后进行。(1)旷场实验和高架十字迷宫,评价罗氟司特对AD小鼠的焦虑行为焦虑恐惧行为的影响。(2)新物体识别和水迷宫,评价罗氟司特对AD小鼠学习记忆能力,的影响。(3)悬尾实验和强迫游泳实验,评价罗氟司特AD对小鼠抑郁状态的影响。3、病理学观察罗氟司特对AD的保护作用:主要进行HE染色,行为学结束后,取小鼠脑组织,4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、苏木素-伊红染色,观察罗氟司特对AD小鼠神经损伤的的保护作用。4、探讨罗氟司特对小鼠行为学影响的机制:行为学实验结束后,处死小鼠,取脑组织,分离皮质和海马,制备其组织匀浆。通过以下蛋白的检测,初步探索罗氟司特对行为学影响的作用机制。(1)Elisa实验检测大脑皮质及海马cAMP蛋白水平。(2)western blot检测CREB、pCREB、BDNF、NPY、Bcl-2、Bax及PDE4亚型蛋白的表达,初步探索罗氟司特的作用机制。5、实验数据用SPSS16.0软件进行统计,多组样本间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05时具有统计差异。结果1、罗氟司特对AD小鼠认知功能的改善作用(1)新物体识别实验:在此实验中,认知指数为反映小鼠认知功能的指标,认知指数=探索新物体时间/[探索新物体时间+探索旧物体时间]。本实验发现AD小鼠认知指数明显低于空白对照组,而罗氟司特能改善AD小鼠认知指数的下降,尤其罗氟司特高剂量组具有显著性统计学差异。(2)水迷宫实验:分为定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验中,以寻找平台的潜伏期为主要评价认知功能的指标。结果显示:随着训练天数的增加,各组小鼠找到平台的潜伏期逐渐缩短。而从第二天起,与空白对照组相比,AD小鼠找到平台潜伏期明显延长,而从第三天起,罗氟司特能明显改善AD小鼠的认知障碍,使寻找平台潜伏期缩短。第五天的空间探索实验中,小鼠第一次经过平台的时间,模型组较对照组时间延长,有显著性差异;给药低剂量组较模型组时间缩短,有显著性差异;给药高剂量组较模型组时间缩短,有显著性差异。空间探索实验中1min内经过平台的次数,模型组较对照组经过平台的次数明显减少,有显著性差异;给药低剂量组较模型组经过平台的次数明显增多,有显著性差异;给药高剂量组较模型组经过平台的次数明显增多,有显著性差异。2、罗氟司特对AD小鼠的焦虑状态的改善作用(1)旷场实验中,小鼠在周围探索的时间,模型组较对照组时间延长,有显著性差异;给药高剂量组较模型组显著缩短,有显著性差异。小鼠到达中央区域的次数,给药组较模型组到达次数显著增多,有显著性差异。在中央区域停留的时间;给药高剂量组较模型组时间显著延长,有显著差异。(2)高架十字迷宫中,小鼠在开臂中停留的时间,模型组较对照组停留时间明显缩短,有显著性差异;给药高剂量组较模型组停留时间显著延长,有显著性差异。3、罗氟司特对AD小鼠的抑郁状态的改善作用(1)悬尾实验中,小鼠不动的时间模型组较对照组明显延长,有显著性差异;给药高剂量组较模型组明显缩短,有显著性差异。(2)强迫游泳实验中,小鼠不动的时间模型组较对照组明显延长,有显著性差异;给药低剂量组与模型组无显著性差异;给药高剂量组较模型组明显缩短,有显著性差异。4、罗氟司特能改善AD小鼠的病理学损伤及细胞的凋亡(1)HE染色对照组细胞数量多且排列紧密整齐,模型组细胞排列紊乱,数量减少,间隙大,给药组相对模型组均有改善。(2)罗氟司特调节AD小鼠凋亡蛋白的表达在小鼠脑组织皮质区,与对照组相比较,AD小鼠Bcl-2/Bax明显降低;与AD小鼠相比较,罗氟司特组Bcl-2/Bax明显增高。而在海马区,与空白对照组相比较,AD小鼠Bcl-2/Bax明显降低;与AD小鼠相比较,罗氟司特高剂量组Bcl-2/Bax明显增高。5、罗氟司特能改善AD小鼠行为学的可能机制(1)罗氟司特可调控PDE4/cAMP/PKA/CREB信号通路蛋白与对照组相比较,AD小鼠皮质区PDE4D含量没有明显变化;与AD小鼠相比较,罗氟司特组PDE4D含量明显减少。而在小鼠海马区,与对照组相比较,AD小鼠PDE4D含量明显增加;与AD小鼠相比较,罗氟司特组PDE4D含量明显减少。与对照组相比较,AD小鼠皮质区PDE4B含量没有明显差别;与AD小鼠相比较,罗氟司特高剂量组PDE4B含量明显减少。而在小鼠海马区,与对照组相比较,AD小鼠PDE4B含量明显增加;与AD小鼠相比较,罗氟司特组PDE4B含量明显减少。在小鼠脑组织的皮质区,与空白对照组相比,AD小鼠pCREB/CREB比值明显降低;与AD小鼠相比较,罗氟司特组pCREB/CREB比值明显升高;在小鼠海马区,与对照组相比,AD小鼠pCREB/CREB比值明显降低;与AD小鼠相比较,罗氟司特高剂量组pCREB/CREB比值明显升高。在小鼠脑组织皮质和海马区,与对照组相比,AD小鼠cAMP的含量明显增高;与AD小鼠相比较,罗氟司特高剂量组cAMP含量明显增加。(2)罗氟司特可调控BDNF的表达在小鼠海马区,与对照组相比,AD小鼠BDNF蛋白表达明显减少;与AD小鼠相比,罗氟司特组BDNF蛋白表达明显增多。在小鼠皮质区,与对照组相比,AD小鼠BDNF蛋白表达明显减少;与AD小鼠相比,罗氟司特组BDNF蛋白表达明显增多。(3)罗氟司特可调控APP、BACE1的表达小鼠脑组织中皮质区,与对照组相比较,AD小鼠APP含量明显增加;与AD小鼠相比较,罗氟司特高剂量组APP含量明显减少。在小鼠海马区,与对照组相比较,AD小鼠APP含量明显增加;与AD小鼠相比较,罗氟司特高剂量组APP含量明显减少。在小鼠脑组织皮质区,与对照组相比,AD小鼠BACE1蛋白表达含量明显升高;与AD小鼠相比,罗氟司特组BACE1表达含量明显降低;在海马区,与对照组相比,AD小鼠BACE1蛋白表达含量明显升高;与AD小鼠相比,罗氟司特组BACE1表达含量明显降低。结论1、罗氟司特可以改善APP/PS1双转基因AD小鼠的认知功能、焦虑行为及抑郁状态。2、罗氟司特对APP/PS1双转基因AD小鼠行为学的改善,可能通过其抑制PDE4B、PDE4D的表达,进而通过升高cAMP水平,促进CREB的磷酸化,促进BDNF的表达,减少细胞的凋亡有关;本课题研究发现罗氟司特还能降低APP、BACE1的表达。