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球孢白僵菌是国内外广泛应用于害虫防治的昆虫病原真菌。病原真菌侵染寄主昆虫过程主要涉及以下几个方面,孢子附着于寄主体壁、萌发并形成侵染结构附着胞、分化出侵染菌丝穿透体壁、菌体在血腔内增殖并引起致病死亡等环节,其中附着胞的形成是穿透昆虫体壁的关键步骤。研究附着胞形成的分子机制,对于揭示昆虫病原真菌侵染致病有重要意义。Bbmpk1信号途径是调控球孢白僵菌附着胞形成的关键途径,破坏Bbmpk1阻断该途径,导致病原菌不能形成附着胞。为揭示Bbmpk1调控附着胞形成的分子机理,课题组前期构建了野生菌株和Bbmpk1突变体在附着胞形成时期的SSH文库。研究SSH文库中的差异表达基因功能,对认识Bbmpk1调节球孢白僵菌附着胞形成及侵染致病机制十分必要。基于此,本论文从SSH文库中选择了一个在突变体中表达显著下调的克隆A929(GenBank:GR979555.1)为研究对象,通过表达分析、RNAi下调表达、超量表达及突变关键位点等方法研究了该基因与球孢白僵菌附着胞形成及侵染致病的关系。主要研究结果如下：1.基因克隆和序列分析序列分析发现,A929克隆的编码基因含有552bp ORF,编码183个氨基酸的多肽,分子量为20.9kDa,等电点为6.77。BlastX分析结果表明,该基因编码蛋白与Metarhizium anisopliae Arf1、Magnaporthe oryzae Arf、Saccharomyces cerevisiae Arf1和Aspergillus nidulans arfA等ADP核糖基化因子高度同源,相似性达到92-98%,因此将其命名为BbarfA (Beauveria-bassiana-ADP-Ribosylation-Factor-A)。系统进化树分析表明,BbarfA属于ARF1基因家族。该基因编码蛋白含有多个ARF的保守特征序列,在N末端第2位含有甘氨酸十四烷基化位点,在第24至第30位氨基酸之间存在一个保守的GTP结合特征序列,在第67至第71位氨基酸间存在一个保守的GTP水解特征序列。2. BbarfA表达分析表达特性结果表明,BbarfA在以昆虫血淋巴为唯一营养源的培养基中转录水平显著高于在CZM、PDA和SDY的转录水平。分生孢子萌发过程中的转录水平检测结果发现,BbarfA在孢子中的转录水平较高,在球形膨大时期(萌发4h)表达显著上调,之后随着芽管出现和菌丝伸长(萌发8h),BbarfA转录水平逐渐降低。由此推测,BbarfA可能与病原菌在昆虫血腔内的生长等生理过程和分生孢子的萌发相关。3. BbarfA与球孢白僵菌发育分化以及侵染致病的关系为进一步明确BbarfA的功能,本论文采用RNAi下调BbarfA、超量表达BbarfA、GTP结合位点突变的BbarfAD26G和GTP水解位点突变的BbarfAQ711等方法,研究了该基因与球孢白僵菌发育分化以及侵染致病的关系。BbarfA影响球孢白僵菌分生孢子萌发生物学特性分析表明,RNAi下调、超量表达BbarfA和BbarfAD26G转化子的产孢、菌落形态和生长速率与野生菌株无明显差异,但改变BbarfA表达模式(RNAi或超量表达)以及超量表达BbarfAQ711影响了孢子萌发。其中BbarfA下调(RNAi)加快了孢子萌发速度,萌发中时(GT50=9.32h)比野生菌株(GT50=10.23h)缩短了0.91h；而超量表达BbarfA和BbarfAQ711则延迟了孢子萌发速度,萌发中时分别比野生菌株延长了1.02h和0.3h。超量表达BbarfAD26G菌株孢子萌发与野生菌株无明显差异。由此推测,BbarfA是影响球孢白僵菌分生孢子萌发的一个重要因子。BbarfA影响球孢白僵菌对H202的敏感性逆境胁迫反应检测结果表明,RNAi、超量表达BbarfA、BbarfAD26G和BbarfAQ711对球孢白僵菌高渗和高温胁迫反应无明显影响,但均增强了菌株对H202的敏感性。在正常条件下和H202胁迫条件下检测抗氧化相关基因在各转化子及野生菌株中的转录水平,结果发现在H202胁迫条件下超氧化物歧化酶(Sod-3、4夕、过氧化物酶(Pod-3)、硫氧还蛋白(Trx)在各转化子中转录水平显著下调,过氧化氢酶(Cat-1、2、4)、超氧化物歧化酶(Sod-1、2)和过氧化物酶(Pod-1、2)等基因表达模式与野生菌株也存在明显差异。由此表明,BbarfA与球孢白僵菌的H202敏感性相关,各转化菌株对H202敏感性增强可能与干扰了部分抗氧化相关基因的表达有关。BbarfA影响球孢白僵菌毒力附着胞诱导发现,各转化菌株附着胞形成与野生菌株无明显差异。利用“经典”体壁侵染和微量注射分生孢子到昆虫血腔两种方式进行生物测定,结果表明,下调BbarfA表达水平(RNAi)显著增强了菌株毒力,半致死时间LTso比野生菌株缩短了17.1h和10.7h；而超量表达BbarfA和BbarfAQ711则显著降低了菌株毒力,半致死时间分别比野生菌株延长了11.6h、8.9h和3.5h、2.9h。超量表达BbarfAD26G菌株则对菌株的毒力无明显影响。由此推测,BbarfA影响球孢白僵菌的毒力。