芽胞杆菌属（Bacillus）由低G+C含量产芽胞的革兰氏阳性杆状细菌组成,作为重要的微生物资源,其分类体系的研究对挖掘潜力菌株、提升应用价值具有重要作用。源于分类手段的改进、分类指标的变化以及新种的不断发现,芽胞杆菌属的分类系统多次发生重大变更。脂肪酸是细菌细胞膜的重要组成物质,受细胞膜上遗传物质的控制,具有灵敏度高、成分高度保守和含量稳定等特点,在细菌中已发现300多种脂肪酸,其碳链长度、双键位置和功能团组合的不同使其成为有效的分类标记。基于脂肪酸检测技术开发的Sherlock微生物鉴定系统（Sherlock MIS）具有操作简单、成本低、检测快速、准确度高和自动化等优点,但Sherlock MIS数据库中芽胞杆菌属种类仅有25种（占芽胞杆菌属比例的13.8%）,且更新速度很慢,无法满足鉴定分类的需要。本实验室通过国际合作研究,从德国菌种保存中心（DSMZ）引进芽胞杆菌属种类的模式菌株。在此基础上,通过梯度实验比较不同的测定条件对脂肪酸结果的影响,确定本研究所采用的芽胞杆菌属种类的脂肪酸测定方案；以该方案测定了90种模式菌株的脂肪酸,以脂肪酸标记为指标,构建适用于芽胞杆菌属的新型系统发育分类体系；利用该分类体系开展新种寻找及芽胞杆菌功能菌株筛选工作。主要研究结果如下：1. 芽胞杆菌属种类的脂肪酸测定条件的研究在细菌培养和脂肪酸提取阶段,实验结果显示芽胞杆菌属种类的脂肪酸鉴定结果受到皂化时间、脂肪酸提取试剂量、获菌量、培养温度、培养时间和培养基等影响。皂化时间在25-30 min之间的测定效果较好；皂化试剂量为1.0 mL时、甲基化试剂量为1₅ mL时,球形芽胞杆菌的脂肪酸鉴定效果最好；获菌量为2040 mg时可以较好地将芽胞杆菌鉴定种；脂肪酸提取最佳培养温度是28℃；培养时间24 h为脂肪酸检测结果最好；采用TSBA培养基的脂肪酸测定结果最好。在脂肪酸检测阶段,实测对比Sherlock MIS微生物鉴定系统和气质联用（GC/MS）两种方法,Sherlock MIS因检测时间短（仅需7 min,GC/MS需要45 min）等优点更适合于芽胞杆菌属种类的脂肪酸鉴定。选取10种芽胞杆菌进行的重复性验证结果表明,根据实验结果建立的测定方案具有较好的可靠性。2.芽胞杆菌属脂肪酸系统发育研究测定了芽胞杆菌属90个种（亚种）的脂肪酸成分,共检测到29个脂肪酸生物标记,脂肪酸碳链长度从10到20,前6个相对百分比含量总和最大的脂肪酸是15：0anteiso、15:0 iso、17:0 anteiso、16:0、17：0 iso和16：0 iso；在测定的90个种（亚种）的脂肪酸组成中,150 anteiso和15：0 iso属于高含量完全分布,170 anteiso、16:0、17:0 iso口16：0 iso属于中含量不完全分布,其余23个标记属于低含量不完全分布；多样性分析则表明芽胞杆菌属种类的脂肪酸生物标记可以分为高多样性高含量类、高多样性中含量类和低多样性低含量类。根据脂肪酸生物标记分布特性和多样性,选取10种脂肪酸参数即16:0 iso、16:0、17:0 iso、17:0 anteiso、 15:0 iso、15:0 anteiso、15:0 iso/15:0 anteiso、17:0 iso/17:0 anteiso以及香农指数（H’）和均匀度指数（f）构建芽胞杆菌属种类的脂肪酸系统发育分类体系,可将90种（亚种）芽胞杆菌分为5个脂肪酸群,分别为第Ⅰ群,蜡状芽胞杆菌脂肪酸群、第Ⅱ群,枯草芽胞杆菌脂肪酸群、第Ⅲ群,嗜碱芽胞杆菌脂肪酸群、第Ⅳ群,嗜酸芽胞杆菌脂肪酸群和第V群,嗜温芽胞杆菌脂肪酸群。3. 芽胞杆菌属脂肪酸群的生物学特性将25个生理生化指标（表型分类鉴定指标）聚类分析与脂肪酸聚类结果相比较,发现两者的芽胞杆菌种类聚类结果相同。每种脂肪酸群具有特异的生理生化特征：第1群蜡状芽胞杆菌脂肪酸群为好氧,明胶液化反应为阳性；第啉群枯草芽胞杆菌脂肪酸群为V-P反应为阳性；第Ⅲ群嗜碱芽胞杆菌脂肪酸群为兼性好氧、嗜碱,水杨苷反应为阳性；第1V群嗜酸芽胞杆菌脂肪酸群为嗜酸；第V群嗜温芽胞杆菌脂肪酸群为兼性厌氧、嗜温,能利用木糖。因此,芽胞杆菌的脂肪酸系统发育分类体系具有生理生化特征意义,这是其他分类方法所不具有的,有望成为一种新的分类体系。选择芽胞杆菌属种类的脂肪酸群的种类进行生物学特性研究,结果表明第Ⅰ类脂肪酸群产生的15：0 iso与不饱和脂肪酸含量较多,菌落表现出湿润,第Ⅱ类和第Ⅳ类脂肪酸群产生150 anteiso型脂肪酸含量多,菌落表现出干燥或粘稠状。16SrRNA、gyrB和rpoB基因系统发育分析表明,3种基因不能用于所有芽胞杆菌属种类的分类。但若与脂肪酸系统发育分析结合,可以快速地选出合适的基因标记：gyrB基因适合第Ⅰ类脂肪酸群,rpoB基因可以用于第Ⅰ类、第Ⅲ类和第Ⅳ类脂肪酸群的种类鉴定,第Ⅲ类和第Ⅳ类利用16S rRNA就可以相互区分。脂肪酸系统发育分析可以反映芽胞杆菌的生态环境：第Ⅰ类脂肪酸群的种类主要分布在湿润环境,第Ⅱ类脂肪酸群主要在碱性干燥或高温的极端环境,第1V类脂肪酸群主要在酸性环境。4. 基于脂肪酸系统发育的芽胞杆菌新种发现与鉴定基于芽胞杆菌属的脂肪酸系统发育分析,在已分离的芽胞杆菌中发现了3个新菌株,进一步的分类特征研究证明这3个新种是芽胞杆菌属的新种（待发表）。新种特征具体描述如下：新种1兵马俑芽胞杆菌Bacillus bingmayongensis（MS）:从陕西西安市秦始皇兵马俑坑中分离出1株轻度嗜热、好氧、革兰氏阳性杆状细菌。该菌株FJAT-13831r接触酶和氧化酶反应为阳性。生长温度范围15-45℃（最佳30℃）,pH范围4.0-10.0（最佳为pH 7.0）,可在0-5%NaCI浓度下生长（最佳0%）。NA培养基上,菌落灰白色、圆形、扁平、边缘不整齐。经16S rRNA和gyrB基因系统发育分析表明,FJAT-13831T属于芽胞杆菌属,与最相近菌株B. pseudomycoides DSM 12442T的16S rRNA和g yrB基因相似性分别为99.72%和93.8%,DNA G+C含量为36.5mol%,DNA-DNA杂交同源性为69.1%（低于70%）,基因组ANI相似性为91.47%。主要脂肪酸为15:0 iso（21.03%）、15:0 anteiso（7.39%）、13:0 iso （7.66%）、16:0 （9.83%）、15:1 iso w5c（5.12%）和17:0 iso（11.49%）。主要呼吸醌为MK-7（89%）,MK-5（8%）和MK-4（2%）占少量。细胞壁主要氨基酸为meso-diaminopimelic acid（DAP）。上述多相分类结果表明FJAT-13831T是芽胞杆菌属的一个新种,命名为B. bingmayongensis（MS）。新种2仙草芽胞杆菌Bacillus mesonae （MS）:从福建省福清市的一株仙草根部分离到1株芽胞杆菌FJAT-13985T,该菌细胞杆状,运动,好氧,革兰氏阳性,接触酶反应阳性,氧化酶反应阴性。生长范围pH 5.7-9.0（最佳pH 7.0）,生长温度20-45℃（最佳为30℃）,可在0-2%NaCI浓度下生长（最佳为0-1%）。16S rRNA系统发育分析显示FJAT-13985T与其相近菌株B. drentensis、B. vireti、B. novalis的16S rRNA序列相似性分别为97.85、97.69和97.58%,DNA-DNA同源性分别为36.63、12.11和32.08%,DNA G+C含量为41.64 m01%。主要脂肪酸为15：0 iso（40.80%）和15：0 anteiso（23.33%）。细胞壁主要氨基酸组分为meso-DAP。主要呼吸醌为MK-7。上述多相分类结果表明FJAT-13985T是芽胞杆菌属的一个新种,命名为B. mesonae（MS）。新种3慈湖芽胞杆菌Bacillus cihuensis（MS）:从台湾桃园县大溪镇采集的土壤中分离到1株芽胞杆菌FJAT-14515T,细胞杆状,好氧,革兰氏阳性。菌落扁平,边缘不规则,浅黄色。生长温度范围20-35（最佳30℃）,pH范围6-9为（最佳7.0）,可在0-5%NaCl浓度下生长（最佳0-1%）。FJAT-14515T与其近缘种B. muralis和B. simplex的16S rRNA序列相似性为分别为97.55%和97.48%,DNA-DNA同源性为分别为61.53%和58%,DNA G+C含量为35 m01%。主要脂肪酸为150 anteiso （40.63%）、15:0 iso（20.70%）、16：0（9.40%）和14：0 iso（9.98%）。上述多相分类结果表明FJAT-14515T是芽胞杆菌属的一个新种,命名为B. cihuensis（MS）。5. 基于脂肪酸分析芽胞杆菌生防菌筛选及鉴定以植物细菌性病害病原菌青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）为靶标,从土壤中筛选获得菌株FJAT-B对青枯雷尔氏菌的抑菌作用最强。表型特征、16S rRNA和ITS序列及脂肪酸分析结果表明菌株FJAT-B为解淀粉芽胞杆菌（B.amyloliquefaciens）。从我国不同地区采集的土样中分离到300余株芽胞杆菌,以真菌性病害香蕉枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）为靶标筛选获得4个对香蕉枯萎病病原荫且右碾桔辅：作用的菌株。编号分别FJAT-4537、FJAT-4539, FJAT-4543和FJAT-4544,经16SrRNA序列鉴定均为多粘类芽胞杆菌（Paenibacillus polymyxa）。它们的生物学特性基本相同,主要脂肪酸为15：0anteiso,抑菌活性与脂肪酸14：0呈负相关,与17：0 anteiso呈正相关。抑菌效果随着菌液稀释倍数（10-100倍）的提高而降低,稀释100倍时仅FJAT-4539有较强抑菌作用；抑菌能力对温度极其敏感,菌液加热到60℃以上即失去抑菌活性；pH 9时均对病原菌具有强抑菌性；对紫外线的耐受力都很强。综合结果表明菌株FJAT-4539对香蕉枯萎病的抑菌效果最好,具备较好的应用潜力。