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颗粒酶(Granzyme)是外源性的丝氨酸蛋白酶,来自细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)释放的细胞浆颗粒。人源的颗粒酶有5种,分别为颗粒酶A(GzmA)、颗粒酶B(GzmB)、颗粒酶K(GzmK)、颗粒酶H(GzmH)、颗粒酶M(GzmM),这些颗粒酶在NK和CTL杀伤靶细胞过程中发挥重要作用。以前对GzmK的研究主要集中在其对细胞凋亡的影响,目前已有文献和我们实验室前期的研究结果发现,GzmK可以通过激活蛋白酶激活受体(PAR)参与炎症反应。蛋白酶激活受体是G-蛋白偶联受体,能够被蛋白酶水解而激活。已有大量的证据表明PAR在包括乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌和结肠癌等恶性肿瘤的发生、发展和转移中发挥重要作用。因此,研究GzmK是否对肿瘤细胞的增殖和迁移具有一定的影并阐明其分子机制具有重要的意义。首先,为了获得具有生物学活性的人活性颗粒酶K重组蛋白,我们利用本实验室构建的含人活性颗粒酶K基因的重组质粒pET24a(+)-GzmK转化大肠杆菌BL21,获得能够表达人活性颗粒酶K的重组菌。将大量诱导表达的菌体裂解后分离包涵体,经变性、复性和亲和层析后制备人颗粒酶K重组蛋白,活性鉴定结果表明它具有较好的生物学活性。其次,为了明确GzmK对肿瘤细胞的增殖和迁移的影响,我们以乳腺癌细胞MDA-MB-231为细胞模型,利用MTT,流式细胞术,划痕实验以及Transwell等方法分析GzmK对肿瘤细胞增殖和迁移的影响作用,并检测了相关分子的表达情况。研究结果发现,GzmK可以促进乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和迁移,而且这种促进作用具有浓度依赖的特点,与肿瘤增殖和迁移相关的分子如VEGF、MMP-2和MMP-9的表达水平均出现上调,而与细胞周期相关的分子如P21的表达水平出现下调。信号通路的检测结果表明,ERK1/2信号通路的激活与GzmK介导的乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖与迁移有关。最后,为了进一步探讨GzmK促进乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和迁移的影响是通过何种受体介导的,我们在分析了PAR在乳腺癌细胞上的表达谱之后,利用了PAR抑制剂来研究PAR是否参与了由GzmK引起的细胞增殖和迁移。研究结果发现,PAR-2的抑制剂可以抑制由GzmK引起的乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和迁移,而且抑制了由GzmK引起的ERK1/2的磷酸化水平,表明PAR-2与GzmK引起的肿瘤细胞的增殖和迁移有关。因此,本研究结果表明颗粒酶K可以通过激活PAR-2而参与肿瘤细胞的增殖和迁移,并且这种作用是通过激活ERK1/2通号通路实现的。该研究结果为阐明GzmK参与肿瘤的发生、发展提供了实验依据,并为进一步阐明炎症与肿瘤之间的关系奠定了一定的理论和实验基础。