应激(stress)是在内外环境变化的刺激下,机体出现的非特异性全身反应,包括精神、神经、内分泌和免疫等方面。在众多应激的人群中,军人是一个特殊的群体。军人的职业特点就意味着要经常面对高强度的应激。战场应激反应,是军人在战争时期极易发生的一种应激反应,包括急性应激和慢性应激。急性战场应激反应多在军人进入突发、意外、恐怖、紧张、危险、残酷的环境中即刻或几分钟内出现。其主要表现为生理性的过度激起,可能发生威胁生命的行为,该行为持续数分钟到数小时。发生急性战场应激反应时易出现记忆力下降、注意力不集中、反应能力下降、视觉敏感力和言语交谈能力下降、无目的的动作、判断能力下降、很难执行甚至是简单的任务、军事作业能力下降,后期甚至出现创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder, PTSD)等现象。慢性战场应激反应是军人长期处于战争环境中所产生的一种应激反应,表现为低活度的状态、脱离群体、抑郁、违反纪律、酗酒和物质滥用等现象。因此战场应激使部队战斗力受到严重影响,也是造成非战斗性减员的主要原因之一。对军人来说,急性应激反应所持续的时间正是其执行作战、救援、维稳、阅兵等任务的关键期。而在现代高科技下,认知能力所占的权重越来越大。故如果能预防急性战场应激所造成的认知损伤,将能极大地提高部队的战斗力。而目前对于应激敏感人员的筛查尚缺乏特异性的生物学指标,主要为临床评定量表。但是该方法存在主观性强、重复率低、准确性和特异性均不高等问题。另一方面,对于战场急性应激,主要的干预措施为心理咨询、心理治疗,且为事后干预,尚缺乏防治药物。本研究从急性战场应激所造成的认知损伤入手,一方面寻找筛查抗应激人员的生物标志物,另一方面发现预防急性应激致认知损伤的药物。为了达到以上两方面的目的,本研究首先模拟战场中突发的急性复杂的应激因素,建立了急性多重应激致认知损伤的动物模型,并对模型的学习记忆能力和血浆皮质酮浓度进行了检测；其次,采用高尔基染色技术对所建立的急性多重应激致认知损伤模型的神经元数目、树突以及突触结构的变化进行了检测;进而,采用PCR芯片技术检测了急性多重应激致认知损伤模型的海马、皮层和血液中可能与应激和认知有关分子的mRNA表达变化,接着将不同部位差异表达分子及其树突结构的变化进行了相关性分析,并对其功能进行了生物信息学解析,发现了急性多重应激致认知损伤的标志性分子；最后,考察了组分中药LW-AFC对急性多重应激致认知损伤的预防作用,发现LW-AFC具有改善被动回避反应能力和调节皮层相关分子表达变化的作用。具体研究结果如下：一、急性多重应激致认知损伤的机制研究1.急性多重应激致认知损伤动物模型的建立模拟战场中突发的急性复杂的应激因素,如枪、炮、地雷等武器形成的震波和行军颠簸、高分贝的噪声、爆炸引起的强光、饥饿、缺水、装备束缚、人员拥挤、看到战友伤亡的场面、发生于数小时内。本研究对应给予BALB/c小鼠5hr的摇床振荡、噪音、强光刺激、禁食、禁水、束缚、振荡时相互碰撞、看到同伴不舒服状态的刺激。其中,根据光强、振荡速度及噪音强度参数的不同将应激分为轻、中和重度三个应激程度,检测三种条件下模型动物学习记忆能力及应激激素水平的变化。结果如下：1.1急性多重应激致认知损伤动物模型的学习记忆能力1.1.1被动回避反应能力给予BALB/c小鼠三种程度的应激后,采用跳台实验方法检测动物被动回避反应能力。结果发现,应激后成功小鼠的百分率和潜伏期出现程度依赖性地下降,其中重度应激组的潜伏期与对照组相比下降明显(P<0.05)。而应激后的错误次数出现程度依赖性地升高,其中重度应激组的错误次数与对照组相比差异明显(P<0.05)。这些结果显示,急性多重应激可以程度依赖性地导致小鼠被动回避反应能力损伤。1.1.2物体识别记忆能力采用新异物体识别实验方法检测动物的物体识别记忆能力。结果发现,对照组及轻度应激组动物探索新物体的时间明显长于探索旧物体的时间,即对新、旧两物体探索时间有明显差别,说明动物仍具有对新异物体感兴趣的特性,即对旧物体有记忆能力；而中度应激组和重度应激组的动物对新、旧两物体的探索时间无明显差别,说明应激明显损害了动物对旧物体的记忆能力。结果提示急性多重应激程度依赖性地损伤了受试动物的物体识别记忆能力。1.2急性多重应激致认知损伤动物模型的血浆皮质酮含量为检测不同程度急性多重应激条件下受试小鼠血浆皮质酮水平的变化,在应激开始后30、60、90和120min以及应激结束后4、8和16min,我们对受试动物采血,取血浆,并用ELISA的方法检测了它们血浆皮质酮的含量。结果显示,无论是在应激开始过程中还是结束后均检测到三个应激组的血浆皮质酮浓度明显高于对照组,但三者之间无明显区别。结果提示,应激可引起血浆皮质酮浓度升高,但其浓度变化幅度与应激程度的大小无明显关系。2.急性多重应激对树突和突触结构的影响为观察急性多重应激对受试动物学习记忆相关脑区树突和突触结构的影响,本研究在给予受试小鼠轻、中和重度应激后30min,取一半脑用于高尔基染色观察脑组织树突结构和透射电子显微镜观察脑组织突触超微结构(另一半脑用于分子检测),并对整个半脑脑区及海马和皮层高尔基染色显示的树突长度、分支数目和树突棘密度进行定量分析。结果显示,急性多重应激对整个半脑脑区、海马和皮层的神经元数目均无明显影响,但却显著地损伤了海马和皮层的树突和突触结构。大脑皮层以及其各功能分区包括视皮层、听觉皮层和嗅皮层的树突长度、分支数目和树突棘密度测量结果显示：与对照组相比,重度应激组的整个大脑皮层的树突棘密度明显降低,中度和重度应激组视皮层树突长度明显缩短,而轻度应激组听觉皮层树突分支数目明显增加。不同应激程度组比较的结果显示,重度应激组听觉皮层树突棘密度减少程度显著高于轻度和中度应激组。海马以及其各分区包括齿状回、CA1、CA2和CA3的树突长度、分支数目和树突棘密度测定的结果显示,与对照组相比,三种程度的应激均降低了海马和海马CA1区的树突棘密度；轻度应激降低了海马CA1的树突长度；重度应激使海马CA3区的树突分支数目减少。采用透射电子显微镜观察了不同程度的急性多重应激对大脑皮层及海马突触结构的影响,结果发现,急性多重应激降低了突触囊泡的数目、增加了突触间隙、降低了突触的曲率并减少了突触后膜致密质的厚度。其中重度应激组与对照组相比对突触囊泡的数目以及突触的曲率降低最明显,这些结果显示,急性多重应激程度依赖性地损伤了海马的突触结构。3.急性多重应激对中枢和外周mRNA表达的影响为探索急性多重应激对受试小鼠海马、皮层和外周血中与应激和认知有关的基因表达情况,采用PCR芯片的方法检测了有文献报道的90个可能与应激和认知功能有关分子mRNA的表达情况,结果发现：3.1海马mRNA的表达在海马中,轻度应激引起ACHE、NEFH和BACE1等12个分子的mRNA表达上调,而KCNA4、GRIA2、GRIA3、PSEN2和ROCKl的mRNA表达下调：中度应激引起ACHE、 APBB1和UBQLN1等20个分子的mRNA表达上调,而KCNA4、GRIA3和PSEN1的mRNA表达下调；重度应激引起SNCA、NTRK3、KCNA4和NOTCH3的mRNA表达下调,这些基因的表达变化随着应激程度的增加出现7种不同的变化形式。而KCNA4、 NOTCH3、NTRK3和SNCA的mRNA表达呈现应激程度依赖性的表达下降。3.2皮层mRNA的表达在皮层中,轻度应激引起APBB1、CLSTN1和KCNA4等50个分子的mRNA表达下调,而KCNA1的mRNA表达上调；中度应激引起GSN、ITM2C和APBB1等26个分子的mRNA表达下调,而KCNA1的mRNA表达上调；重度应激引起APBB1、CLSTNl和KCNA4等8个分子的mRNA表达下调,而KCNA1的mRNA表达上调,这些基因的表达变化随着应激程度的增加出现了5种不同的变化形式。3.3外周血mRNA的表达在外周血中,轻度应激引起BACE1、CRYAB和FGF2等7个分子的mRNA表达下调,而FOS的mRNA表达上调；中度应激引起BACE1、CRYAB和FGF2等5个分子的mRNA表达下调,而AGER、APP和PSEN1等5个分子的mRNA表达上调；重度应激引起BACE1、CRYAB和FGF2等5个分子的mRNA表达下调,而FOS的mRNA表达上调,这些基因的表达变化随着应激程度的增加出现了5种不同的变化形式。应激组BACE1的表达明显下调,FOS的表达明显上调,二者均与应激程度密切相关。随着应激程度的增加,BACE1下调程度逐渐增加,而FOS上调程度逐渐增加。该结果提示,BACE1和FOS表达变化的程度与应激程度密切相关,而有可能与认知损伤程度相关,有作为应激程度指示剂或认知损伤标志物进行深入研究的必要。3.4差异表达分子与树突结构的相关性分析为探索差异表达分子与树突结构变化之间的相关性,本研究用Pearson相关性分析的方法来考察海马和皮层中树突结构的改变与差异表达分子之间的相关性。结果发现,在皮层中,应激所引起的CLSTN1、PLAU和NOTCH3的表达变化与听觉皮层树突分支数目的变化呈负相关；而TGFB1的表达变化与视觉皮层中树突棘数目的变化呈正相关。在海马中,NOTCH3的表达变化与其CA3区树突的分支数目变化呈正相关。这些结果提示,CLSTN1、PLAU, NOTCH3和TGFB1可能是应激致认知损伤相关的重要分子。3.5各部位间差异表达分子的相关性分析为了探索中枢和外周血之间差异表达分子的关系,本研究用Pearson相关性分析的方法来分析皮层与外周血以及海马与外周血差异表达分子之间的相关性。结果发现,BACE1在皮层和外周血中的表达变化呈正相关,提示外周血中BACE1的变化可以反映其在脑中的变化,有作为认知损伤标志物进行深入研究的必要。4.急性多重应激致树突结构损伤相关分子网络为了找出应激致树突结构损伤的分子网络,本研究用与树突结构变化具有相关性的四个差异表达变化分子CLSTN1、PLAU、NOTCH3和TGFB1作为种子构建PPI网络。结果,我们得到了一个具有59个节点、136个边,网络直径为6的PPI网络。其中,TGFB1、 PLAU和NOTCH3度数(degree)分别为28、12和9,处于网络的核心位置。综合实验和网络分析的结果提示,TGFB1、PLAU和NOTCH3可能是急性多重应激致树突结构损伤的关键分子。进而,我们采用DAVID平台上的GO功能注释和KEGG通路富集的方法分别对PPI网络中的分子进行功能分析。GO功能注释结果显示,跨膜受体蛋白丝氨酸／苏氨酸激酶信号传导通路(transmembrane receptor protein serine/threonine kinase signaling pathway).转化生长因子p受体信号转导通路(TGF-beta receptor signaling pathway)、Notch信号传导通路(notch signaling pathway)排列在前三位。KEGG通路富集的方法所得到的前三位通路分别为：Notch信号传导通路(notch signaling pathway)、补体和凝血级联(complement and coagulation cascades)、转化生长因子p受体信号转导通路(TGF-beta signaling pathway).两个方法的结果提示Notch和转化生长因子p受体信号转导通路与急性多重应激致树突结构损伤关系最为密切,进而提示急性多重应激引起树突结构损伤且最终导致认知损伤的最可能的通路是Notch和TGF-beta信号通路。二.LW-AFC对急性多重应激致认知损伤的预防作用研究1.LW-AFC对急性多重应激模型被动回避反应能力损伤的作用本研究采用跳台实验检测了急性多重应激后小鼠的被动回避反应能力。结果发现,应激组的成功小鼠百分率明显低于对照组,而阳性药和LW-AFC给药后对应激造成的成功小鼠百分率下降现象均有改善作用,其中LW-AFC中剂量和高剂量效果最好。应激组的潜伏期与对照组相比明显下降,而给予阳性药和LW-AFC后对应激造成的潜伏期下降现象均有改善作用,其中阳性药和LW-AFC中剂量和高剂量效果较为明显。另外,应激组的错误次数明显高于对照组,而阳性药、LW-AFC中剂量和高剂量对应激所造成的错误次数升高现象均有改善作用,其中LW-AFC中剂量和高剂量效果最好。结果提示LW-AFC预防给药对急性多重应激造成的被动回避反应能力损伤具有明显的改善作用。2. LW-AFC对急性多重应激模型mRNA表达变化的调节作用跳台实验结束后,小鼠断头取脑,并分离出皮层,进而用PCR芯片的方法检测了皮层中90个与应激和认知功能相关的分子。结果发现,应激使皮层中NEFHvNEFM、 NSF、PLAU、PRKCA、STAT3、STUB1、APBB1、NTRK3、GRIA2和NOTCH3的表达下调。而给予LW-AFC后,NEFH、PLAU、STAT3和STUB1有明显的上调的趋势。3. LW-AFC所调节的能够改善急性多重应激模型认知损伤的分子网络特征应激致认知损伤是通过扰动具有多个生理功能的网络而引起的,LW-AFC是通过调节怎样的分子网络而改善急性多重应激致认知功能的损伤。本研究首先得到了在皮层中LW-AFC所调节的4个应激引起差异表达的分子,即NEFH、PLAU、STAT3和STUB1,以它们作为种子来构建PPI网络,得到了一个具有9个节点、10个边,网络直径为4的特异的PPI网络。其中网络中的9个分子为MAPK1、STAT3、AR、STUB1、NEFH、 PLAT、PLAU、MET和HGF。提示,LW-AFC可能通过调节由MAPK1、STAT3、AR、 STUB1、NEFH、PLAT、PLAU、MET和HGF多个分子组成的相互作用网络,进而改善急性多重应激所引起的被动回避反应能力损伤。随后结合DAVID平台上的GO功能注释和KEGG通路富集的方法分别对LW-AFC所调节的PPI网络中的分子进行功能分析,GO功能注释结果显示酶联受体蛋白信号通路(enzyme linked receptor protein signaling pathway)排在首位。而KEGG通路富集的方法发现癌症途径(Pathways in cancer)排在首位。结果提示,LW-AFC所调节的相互作用分子可能参与酶联受体蛋白信号通路和癌症途径。通过以上研究,得到以下结论：1.不同程度的急性多重应激程度依赖性地引起受试小鼠被动回避反应能力、物体识别记忆能力的损伤以及海马和皮层中树突和突触结构的损伤。其所涉及的关键分子为PLAU、NOTCH3和TGFB1,而关键的信号通路为Notch和TGF-beta信号通路。2.外周血中BACE1和FOS的表达可以反映应激程度的改变,有望成为应激致认知损伤的生物标志物。3. LW-AFC对急性多重应激所致的认知损伤具有保护作用。其发挥该作用的途径可能是调节PLAU、NEFH、STAT3和STUB1等所组成的分子相互作用网络以及其所涉及的酶联受体蛋白信号通路和癌症途径。