研究背景冷暴露与机体健康密切相关,冷暴露易导致冻伤、低体温症的发生;冷暴露也会增加心脑血管的发病风险。近期研究表明,适当的冷环境暴露可以调节免疫平衡,改善机体代谢稳态并有效缓解肥胖、糖尿病的代谢紊乱症状。因此,冷环境因素对于人体健康是一把双刃剑。脂肪组织在机体应对冷暴露中发挥了重要的代谢调节功能。脂肪组织分布遍及全身,主要分为白色脂肪、棕色脂肪和棕色样脂肪。在冷暴露中,白色脂肪一方面利用储存的脂肪垫抵抗热散失,促进脂滴分解,为外周器官提供代谢底物;另一方面促进棕色样脂肪的产生。棕色样脂肪具有和棕色脂肪相类似的作用,发挥解耦联产热代谢功能,参与体温的维持和抵抗低温症的发生。研究证明,冷暴露可以促进脂肪组织产热代谢,缓解机体代谢紊乱症状。因此,阐明冷暴露中机体脂肪组织产热代谢的分子调节机制,一方面可预防冷诱导的相关疾病发生,为低体温症的防治提供干预靶点,另一方面也可以为代谢类疾病提供安全有效的治疗靶标。目前关于脂肪产热代谢的研究主要集中在信号通路和转录相关分子的功能作用方面,而这些复杂的分子信号网络是如何相互协调影响,尚未完全阐明。我们前期研究发现,在冷暴露脂肪产热活化过程中,产热相关分子在转录后水平受到明显的调控。基于这一现象,我们通过多个高通量数据比较分析,筛选到RNA结合蛋白Quaking(QKI)。本课题中,我们构建转基因小鼠模型,利用RNA-IP seq、表达谱芯片以及多聚核糖体分析技术,探讨QKI分子转录后调控产热代谢分子PGC1α、UCP1表达的机制及其在机体能量代谢调节、低体温症及肥胖相关代谢疾病中的作用。研究目的1.证明脂肪组织中QKI表达变化与机体代谢水平的关系;2.探明QKI对脂肪组织细胞产热代谢的调控作用;3.揭示QKI调控脂肪组织能量代谢的分子机制;4.阐明QKI对于靶分子RNA多层次调节的转录后调控特征;5.验证QKI作为靶点在防治低体温症、肥胖及其相关疾病中的作用和意义。研究方法1.通过Western blot、免疫组化、报告基因等实验,检测QKI分子在冷暴露条件下脂肪组织中的表达变化,及受调节的信号通路。构建QKI脂肪特异性敲除小鼠,利用小动物代谢笼、冷暴露模型,检测QKI对机体能量代谢的影响;2.通过Western Bolt、RT-PCR、HE染色、透射电镜观察、氧电极检测,明确QKI对脂肪组织代谢水平的调控作用;3.利用表达谱芯片、RNA-IP Sequencing检测分析,揭示QKI调控的分子信号通路和作用关键分子。建立体外脂肪细胞模型,利用慢病毒感染、si RNA转染技术沉默QKI表达,通过Western blot、RT-PCR、免疫荧光染色等分子生物学方法,验证QKI对于下游靶分子的调控作用,及建立QKI介导的分子信号网络;4.通过体外3’UTR荧光素酶报告系统、RNA半衰期、胞浆胞核分离提取、多聚核糖体分离提取检测,明确QKI对于下游靶分子RNA稳定性、转运及翻译效率的影响;5.构建高脂饮食诱导肥胖的小鼠模型,利用QKI脂肪特异性敲除小鼠和AAV病毒介导的QKI干预方法,分析检测体重、胰岛素敏感性、糖耐量等相关数据,探讨QKI分子在肥胖及其相关代谢疾病发生发展中的功能作用。研究结果1.冷暴露促进脂肪组织中QKI分子的表达。Western blot、免疫组化结果显示,在冷暴露过程中,QKI分子在棕色脂肪组织、皮下脂肪组织中的表达量都呈现出逐渐增高的趋势;通过QKI启动子荧光素酶报告系统实验证明QKI受到c AMP信号通路的转录调控;抑制脂肪组织QKI分子表达促进小鼠机体代谢率,有效抵抗冷暴露导致的低体温症。小动物代谢笼系统检测数据表明,QKI脂肪特异性敲除小鼠基础氧耗率增高、产热增高,自主运动活性没有明显差异。实验揭示,QKI脂肪特异性敲除小鼠抗寒能力增强,有效抵抗冷诱导的低体温症发生,提高机体冷适应能力;2.干预QKI表达激活脂肪组织产热代谢。通过对转基因小鼠脂肪组织Western Bolt、RT-PCR、HE染色、透射电镜观察、氧电极检测分析发现,QKI敲除的棕色脂肪组织氧耗代谢率明显增高,线粒体数目增多,脂滴大小、数目显著减少,产热分子表达水平显著增高,并且在QKI敲除的棕色脂肪组织中线粒体呼吸链氧化解耦联功能明显增高。与棕色脂肪代谢功能改变一致,QKI敲除的皮下脂肪组织氧耗代谢率明显增高,线粒体数目增多,脂滴面积明显缩小,产热分子表达水平显著增高。在冷暴露条件,QKI敲除的皮下脂肪组织中产生更多的棕色样脂肪细胞;3.QKI调控产热信号分子。表达谱芯片的KEGG pathway结果显示,QKI参与AMPK、PPAR以及Insulin等代谢信号通路。GSEA分析表明,QKI参与调节PPARα、Phospholipid metabolism、TCA Cycle and Respiratory electron transport以及Fatty acid triacylglycerol and ketone body metabolism相关的功能基因。RNA-IP Sequencing检测分析提示产热代谢关键分子PGC1α可能是QKI的潜在作用靶点;4.QKI转录后负向调节产热信号通路分子。干预QKI在体外脂肪细胞中的表达,通过Western blot,RT-PCR,免疫荧光染色方法证明,抑制QKI分子促进下游靶分子PGC1α、UCP1的表达,并且证实QKI调控的产热信号途径,主要依赖于PGC1α分子。通过用Forskolin、IBMX刺激细胞c AMP信号通路来模拟体内冷介导的脂肪产热代谢通路,该实验结果表明冷刺激条件下,抑制脂肪组织/细胞QKI分子可以迅速有效激活产热分子的表达,明确QKI在冷暴露条件下发挥的产热“制动”调节作用。通过体外3’UTR荧光素酶报告系统实验,阐明QKI通过结合PGC1α、UCP1 3’UTR上的QRE作用元件,并抑制其荧光素酶的表达活性;RNA半衰期、胞浆胞核分离提取、多聚核糖体分离提取检测结果显示,抑制QKI表达可以显著提升PGC1αRNA稳定性,促进PGC1α、UCP1 RNA的胞浆转运并提高其翻译效率;5.干涉脂肪组织QKI分子表达有效阻止高脂饮食诱导的小鼠肥胖及相关代谢疾病。利用高脂诱导的小鼠肥胖模型,阐明QKI脂肪特异性敲除小鼠可以显著抑制高脂诱导的肥胖,并且该QKI转基因敲除小鼠血液中游离脂肪酸含量、外周脂肪组织及肝脏组织中脂滴堆积水平显著减少。胰岛素敏感性、糖耐量检测实验证明,QKI脂肪特异性敲除小鼠明显提升胰岛素敏感性和糖耐量水平;通过AAV病毒介导的QKI干预方法证明,干预脂肪组织QKI表达可以有效改善高脂摄食诱导的肥胖和葡萄糖耐受水平,提示QKI可以成为一个潜在的肥胖病治疗靶点。研究结论1.QKI参与机体代谢调节,介导棕色脂肪、皮下脂肪产热代谢功能,可能是有效预防冷暴露诱导低体温症的干预靶点;2.QKI负向调控产热代谢信号通路,在冷暴露激活的产热途径中发挥“制动”作用;3.QKI靶向作用于产热分子PGC1α、UCP1 RNA 3’UTR区,负向调节其分子表达水平;4.QKI转录后调控影响PGC1α、UCP1 RNA稳定性、转运及翻译效率;5.QKI介导的脂肪产热代谢功能可以有效地抵抗高脂饮食诱导的肥胖,是防治相关代谢疾病的潜在靶点。