捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)属毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属(Haemonchus)线虫,分布较广。寄生于反刍动物第四胃和小肠,因吸血可导致宿主贫血和衰弱,引起幼龄动物,尤其是羔羊死亡,对畜牧业造成极大经济损失。捻转血矛线虫病传统的防治方法是使用化学驱虫药并结合牧场管理,但随着抗药虫株的出现和蔓延,以及严重的药物残留问题,传统的化学防治方法受到了严峻的挑战。这已经迫使人们将注意力转移到利用免疫学方法来防治该病,尤其是疫苗的开发上。发现新的免疫原性蛋白对发展有效的捻转血矛线虫疫苗是十分必要的。本文利用免疫蛋白组学的方法对捻转血矛线虫成虫的可溶性蛋白以及排泄分泌蛋白展开研究,以期找到一些新的疫苗候选抗原或药靶。为此,我们进行了以下工作：1.捻转血矛线虫成虫免疫蛋白组研究应用免疫蛋白组学的方法分析捻转血矛线虫成虫雌雄虫的可溶性蛋白,在考马斯亮蓝G-250染色的2-D凝胶上分别检测到雄虫662和雌虫680个蛋白点,主要集中在pH5-9范围内。雌雄虫共有的蛋白点是609个。以自然感染的抗捻转血矛线虫的山羊血清作为一抗,对雌雄虫蛋白作western blot分析,分别检测到雄虫193和雌虫196个免疫原性蛋白点。雌雄虫共有的免疫原性点是64个。质谱分析了23个雌雄虫共有的免疫原性蛋白点,数据库检索有结果的点对应的蛋白包括捻转血矛线虫谷氨酸脱氢酶(GDH),以及dim-1,肌动蛋白(actin),珠蛋白样排泄分泌蛋白F6,谷胱甘肽S-转移酶(GST),ATP酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的同系物。除了GDH和GST已经报道过,其它的蛋白均为新发现的捻转血矛线虫的免疫原性蛋白。2.捻转血矛线虫成虫雌雄虫比较蛋白组研究应用蛋白组学的方法比较分析捻转血矛线虫成虫雌雄虫的可溶性蛋白,质谱分析了20个雌雄虫差异蛋白点,这些点包括性别特异的点和丰度上有显著差异的点。数据库检索有结果的蛋白点对应的雄虫特有蛋白有主要精子蛋白msp-49和驱动蛋白klp-17的同系物；对应的雌虫特有蛋白有琥珀酸脱氢酶黄素蛋白亚基的同系物,热休克蛋白20,秀丽隐杆线虫血管内皮生长因子受体ver-4和F32A5.2b蛋白的同系物；谷氨酸脱氢酶以及肌动蛋白同系物在雌雄虫中均表达,且在雄虫中的丰度显著高于雌虫。以自然感染的抗捻转血矛线虫的山羊血清作为一抗,对雌雄虫蛋白作western blot分析,发现谷氨酸脱氢酶、热休克蛋白20、以及肌动蛋白和驱动蛋白klp-17同系物能被抗血清识别。3.捻转血矛线虫成虫排泄分泌蛋白组研究应用免疫蛋白组学的方法分析捻转血矛线虫成虫雌雄虫排泄分泌蛋白,在考马斯亮蓝G-250染色的2-D凝胶上分别检测到雄虫176个和雌虫183个蛋白点,雌雄虫共有的蛋白点是158个。以自然感染的抗捻转血矛线虫的山羊血清作为一抗,对雌雄虫排泄分泌蛋白作western blot分析,分别检测到雄虫149和雌虫156个免疫原性蛋白点,雌雄虫共有的点是121个。质谱分析了20个雌雄虫共有的免疫原性蛋白点,数据库检索有结果的点对应了12种蛋白：捻转血矛线虫24 kDa排泄分泌蛋白(ES24),丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(HcSTK),P100-GA蛋白,金属肽酶和谷氨酸脱氢酶(GDH),以及秀丽隐杆线虫ZK287.1蛋白和烯醇化酶(enolase)的同系物,新杆状线虫CBG13342、CBG07031、CBG03816和CBG24211蛋白的同系物,Procambarus clarkii精氨酸激酶的同系物。其中丝氨酸苏氨酸蛋白激酶,以及精氨酸激酶和5个Caenorhabditis蛋白的同系物作为捻转血矛线虫免疫原性蛋白未曾报道过。4.捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与原核表达根据GenBank上公布的几种线虫的肌动蛋白(actin)基因ORF的序列,设计简并引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出约1,100 bp的条带。基因测序结果表明,该片段完整ORF为1,131 bp,编码376个氨基酸。经BLAST分析表明,其核酸序列与秀丽隐杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等同源性达86%左右；其氨基酸序列与胎生网尾线虫、秀丽隐杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等达98%左右。重新设计表述引物,将该ORF克隆到pET-28a(+)载体中,经酶切鉴定正确后转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。SDS-PAGE表明表达的融合蛋白约46 kDa,以包涵体的形式表达。以自然感染的抗捻转血矛线虫的山羊血清作为一抗,western blot分析结果显示该融合蛋白与抗血清反应出现特异性条带,表明肌动蛋白能够被宿主的免疫系统识别。将表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗血清作为一抗,western blot分析结果显示在43 kDa处出现特异性条带。5.捻转血矛线虫谷氨酸脱氢酶基因的克隆与原核表达根据GenBank上公布的捻转血矛线虫的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)基因(登录号AF000967)的ORF的序列,设计1对引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出约1,600 bp的产物。基因测序结果表明,该片段长度为1,617 bp,编码538个氨基酸。经BLAST分析表明,其核酸序列与已经公布的捻转血矛线虫谷氨酸脱氢酶的ORF同源性为98%；氨基酸序同源性也为98%,表明扩增片段为捻转血矛线虫谷氨酸脱氢酶的ORF序列。将该片段克隆到pET-28a(+)载体中,经酶切鉴定正确后转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。SDS-PAGE表明表达的融合蛋白约63kDa,以包涵体的形式表达。以自然感染的抗捻转血矛线虫的山羊血清作为一抗,western blot分析结果显示该融合蛋白与抗血清反应出现特异性条带,说明谷氨酸脱氢酶能够被宿主的免疫系统识别。将表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗血清作为一抗,western blot分析结果显示在59 kDa处出现特异性条带。