论文部分内容阅读
菠菜(Spinacia oleracea L.)为藜科(Chenopodiaceae)菠菜属,一年生或两年生草本植物,雌雄异株,是一种大面积种植的重要经济作物。菠菜的染色体组成为2n=2x=12,其具有生长周期短、易种植、表型丰富、花原基异型不表达等特点,因此,其为研究雌雄异株植物性别分化分子机制的一种理想材料。截止到目前,国内外学者虽然从细胞学、形态学、生理生化、分子生物学等方面对菠菜的性别分化进行了研究,但是菠菜性染色体仍然缺乏细胞学证据,同时未有性别决定基因克隆的报道。 葎草(Humulus scandens L.)为桑科(Moraceae)葎草属,是一种常见的雌雄异株杂草。葎草雌株的染色体组成为2n=16,具有XX两条性染色体,雄株为2n=17,具有XY1Y2三个较大的性染色体,其同样为研究雌雄异株植物性别分化分子机制的理想材料。然而,与酸模(Rumex acetosa)相比而言,关于葎草的性别决定的分子机制的研究仍然处在非常初级的阶段。 鉴于此,本研究以菠菜和葎草为研究材料,利用SRAP(Sequence Related AmplifiedPolymorphism)分子标记技术对其雌、雄基因池进行性别相关特异片段的筛选,筛选出与性别相关的分子标记,借助染色体荧光原位杂交及斑点杂交技术对特异片段进行了验证,主要研究结果如下: (1)利用相关序列扩增多态性(SRAP)技术对菠菜雌、雄基因池进行性别相关特异片段的筛选。借助聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行了分析,从256对引物组合中筛选出了20对可以稳定扩增出特异条带的引物组合,引物多态性为7.813%。将这20对引物的扩增产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,共扩增出了382条带,多态性条带为76条,多态率为19.9%。选取多态性较好的引物组合进行琼脂糖凝胶电泳检测,并对雄性特异片段进行克隆测序。在获得的序列中,有一个391 bp的雄性特异片段与18s rRNA部分片段同源性较高(同源性高达99%),标记荧光探针之后,经与菠菜中期染色体分裂相进行荧光原位杂交,荧光信号分布于菠菜6条染色体上,还需要对菠菜雌、雄株根尖染色体分别进行荧光原位杂交,已验证杂交荧光信号是否在雌、雄染色体中期分裂相中有差别。 (2)利用相关序列扩增多态性(SRAP)技术对葎草雌、雄基因池进行性别差异片段的筛选,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分析,从初筛后的引物中筛选出了50对可以稳定扩增出特异条带的引物组合,引物多态性为19.53%。将这50对引物的扩增产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,共扩增出了671条带,多态性条带为247条,多态率为36.81%。选取多态性较好的引物组合,进行琼脂糖凝胶电泳,并对雄性特异片段进行克隆测序。在获得的多个序列中,有一个666 bp的雄性特异的片段,经序列分析表明,表明该片段是转座子部分序列。以葎草雌、雄基因组为探针,利用斑点杂交对获得的葎草性别相关特异片段进行验证,结果表明性别相关特异片段均出现阳性信号,表明葎草性别差异片段在雌、雄基因组之间差异较小,无法用斑点杂交手段进行验证,需要借助其他手段进行分析。