目前，损伤、恶性肿瘤和心脑血管疾病已经成为人类健康的头号敌人，现行的医疗方案已经远远不能满足疾病治疗的需要，在90年代兴起的干细胞研究为疾病的治疗提供了崭新思路，干细胞研究因为其巨大的应用前景被美国《Science》杂志评为1999年世界10大科学进展之首，为世人所瞩目。干细胞特有的生物学特征及潜在生物学应用价值成为近年生物学领域的热点课题。正因为干细胞的特殊科学意义及在医学上的应用前景，各国对此都投入了大量的人力物力进行研究，日本把干细胞列入“千年世纪工程”中的4大重点之一；英国议会通过了应用人胚胎进行研究的议案。 神经干细胞(NSCs)是长期具有自我更新能力的细胞，经过不对称分裂神经干细胞可以生成一个祖细胞及另一个干细胞，其中祖细胞进行有限的分裂而分化成神经元及胶质细胞，而干细胞则继续分裂。从哺乳动物及人类的中枢神经系统的一定部位可分离出神经干细胞，如脑室下区、海马齿状回、嗅脑、小脑皮质生发层等。 干细胞疗法近年来已成为治疗多种疾病的新策略，其目的是替代、修复或加强受损的组织或器官的生物学功能，同时干细胞具有自我更新与增殖分化的生物学特性，是基因疗法一种理想的靶细胞。由于神经干细胞具有基因的可操作性，可携带多个外源基因；转染后外源基因在体内体外稳定表达；移植后可整合到宿主脑组织；在宿主脑内迁移等优良特性，使其成为基因治疗的良好载体。 天津医科大学博士学位论文 有关海马神经干细胞的分离及生物学特性的研究，目前国外只有少量报道，国内则未见报道。神经干细胞移植在颅脑损伤方面的应用仅见个别报道，转染白介素12(工L一12)的神经干细胞用于治疗大鼠胶质瘤的研究则未见报道。本实验首先对取自胎鼠或胎儿海马的神经干细胞自我更新及多向分化生物学特性进行研究，并且对NSCs的标记神经上皮干细胞蛋白(nestin)、表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维生长因子(FGF一2)对NSCs的作用、NSCs体内分化等进行系统的研究，随后对NSCs移植修复颅脑损伤后神经功能缺失、转染工L一12的神经干细胞用于免疫基因治疗大鼠颅内胶质瘤进行初步研究。第一部分:神经干细胞生物学特性的研究 对胎鼠及胎儿海马EGF、FGF一2依赖性神经干细胞的分裂增殖、多向分化特性及超微结构进行研究，并且对NSCs的标记nestin、EGF及FGF一2对NSCs的作用、NSCS体内分化等进行系统的研究。 1.应用MTT检测法及5一滨脱氧尿核昔(BrdU)染色观察干细胞的分裂增殖，应用透射电子显微镜观察干细胞的超微结构，应用免疫荧光及免疫组化方法观察干细胞的抗原特性及分化潜能。胎鼠及胎儿海马中存在多潜能神经干细胞，体外培养时其细胞活性不断增加，大多数细胞呈BrdU阳性。在电镜下可见核浆比大，核仁明显，异染色质分散呈小碎片状，胞浆中有很多游离核糖体，线粒体及粗面内质网很少。在适当的条件下神经干细胞可以分化产生具有一定比例的神经元及神经胶质细胞。 2.Nestin是NSCs中的中间丝状蛋白。本实验使用细胞免疫染色、队CS、RT一PCR、Western Blot方法检验取自胎儿海马的NSCs的nestin表达。神经干细胞球体中的细胞几乎均(>90%)呈nestin阳性，但呈神经元特异性烯醇化酶伽sE)阴性，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阴性。通过RT一pCR方法检测到nestin在mRNA水平的表达，Western Blot显示nestin分子量大约为240KD。 3.EGF和FGF一2对NSCs有重要作用，最初由EGF和FGF一2共同作用分离的 天津医科大学博士学位论文hNSCs在去掉一种生长因子(EGF或FGF一2)后细胞增殖立即下降，在FGF一2持续存在时hNSCS产生明显多的神经元，但EGF存在与否对hNSCS的分化无明显影响。 4.在被移植到成年大鼠脑组织内，hNSCS发生部位特异性的分化，并可沿内源性NSCS的移动路径发生迁移。 可见胎鼠或胎儿海马神经干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的未分化细胞，具有不成熟的细胞核及胞浆超微结构，EGF、FGF一2作为外源性信号因子作用于胎鼠海马神经干细胞的相应受体，对其分裂分化可产生重要作用。nestin作为特异性标记可以帮助我们区分NSCs，因而对NSCs移植治疗颅脑疾病有重要的应用价值。NSCs移植后对体内环境信号的恰当反应，及其在体外的大量增殖能力使其在日后的实验及临床应用方面有重要意义。第二部分:神经干细胞移植治疗颅脑损伤后的神经功能缺失 在体外培养中NSCs能够不断分裂增殖，当NSCs被移植到动物体内，可与宿主细胞良好整合，对局部信号产生形态反应，恰当地分化成为不同的神经元及胶质细胞，并沿着神经轴迁移加入正常的神经发育。本实验对NSCS移植修复颅脑损伤后神经功能缺失，间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化，MSCs移植对颅脑损伤修复进行研究。 我们使用自由落体大鼠颅脑损伤模型，全部动物分为4组，假损伤组(Sham)，损伤组(TBI)，治疗对照组(TBI+DF)，治疗组(TBI+N SCs)。损伤组与正常组相比，在伤后48小时及7天运动神经功