水稻是世界上最主要的粮食来源之一，水稻的质量备受关注。随着转基因生物技术的飞速发展，转基因食品逐渐进入了人们的日常饮食中，然而长期多代食用转基因食品是否会威胁人体健康以及转基因食品是否会产生一些对人体有害的非预期效应等成为公众日益关注的焦点，转基因水稻的生物安全性评价显得尤为重要。目前国内外对转基因水稻的研究主要集中在营养成分及啮齿类动物90天喂养实验，其安全性资料仍然比较缺乏，阻碍了转基因水稻商品化推广进程。对于转基因水稻而言，外源基因的导入可能会引起转基因水稻蛋白质种类和含量产生一定的变化，在影响大米蛋白质表达的同时是否产生对人体不利的毒蛋白或其他有害物质等问题仍需深入探讨。由华中农业大学研发的转cry1Ab/1Ac水稻“华恢1号”是一种具有良好抗虫特性的转基因水稻，该转基因水稻于2009年获得我国农业部发放的安全生产证书。然而外源Bt基因的导入是否会引起大米蛋白质组的改变，如产生毒性蛋白以及致敏原等尚没有明确的报道，本论文利用蛋白质组学技术比较转Bt基因水稻与其亲本水稻表达的差异蛋白质，从蛋白质水平变化来评价转基因水稻的安全性，进一步丰富“华恢1号”大米食用安全性评价资料，为转基因大米的食用安全性评价提供科学依据。本论文的主要内容和结果如下：　　（1）大米总蛋白提取方法的比较　　通过对比TCA-丙酮沉淀法与酚-乙酸铵甲醇法提取大米总蛋白，初步建立水稻蛋白质的提取方法，实验结果表明TCA-丙酮沉淀法提取的大米蛋白质能获得良好的二维凝胶电泳图谱，更适用于大米蛋白质组学分析。酚提取法能够去除大米中较多的杂质，但酚提取法通过二维凝胶电泳能识别的蛋白质总数量相对较少，在分子量30kD区域附近还会出现部分蛋白质点丢失和蛋白质点之间相互重叠掩盖的现象，而且实验操作复杂繁琐。TCA-丙酮沉淀法实验操作简单，二维凝胶电泳图谱上检测到的蛋白质点总数量明显多于酚提取法，特别是小分子量区域，且在整个区域均有蛋白点分布，缺点是会因为杂质的残留和蛋白质识别数量多等原因而导致图谱清晰度有所下降。大米蛋白质组学的关键是分析大米的全部蛋白质的特征及功能，应尽量保留大米全部蛋白质，综合两种蛋白质提取方法的优缺点，本论文认为TCA-丙酮沉淀法提取大米蛋白质，更有利于获得能满足大米蛋白质组学研究的二维凝胶图谱。　　（2）改进的胶内酶解法应用于银染凝胶内蛋白质的鉴定　　本论文在差异蛋白质谱鉴定过程中改进了传统银染凝胶的蛋白质胶内酶解方法，主要改进是在酶解时加入低浓度的表面活性剂RapiGest SF提高酶切效率，再进行生物质谱（LC-ESI-MS/MS）鉴定。为了验证改进银染胶内酶解方法在蛋白质组学中的应用，选用Hela细胞全蛋白提取液进行相关实验。实验结果显示改进方法的酶解时间由原来的过夜降至2h，Dithiothreitol（DTT）、Iodoacetamide（IAA）、Trypsin和RapiGest SF的浓度分别为10mM、55mM、0.008μg/μl和0.05％(w/v)时，鉴定蛋白质时的氨基酸覆盖率较传统方法提高了20～30%，单个电泳条带中蛋白质鉴定数量提高了20～40%，增加了蛋白质鉴定结果的可靠性，提高了复杂蛋白样品混合物的蛋白质鉴定数量，另外鉴定灵敏度也有所提高，酶解时间也大大缩短，能很好地满足银染胶内低丰度蛋白质的鉴定要求。实验结果表明改进的酶解方法可提高低丰度蛋白的鉴定率，提高复杂的混合样品电泳分离后检测灵敏度。　　（3）实验材料的验证　　为了验证Bt蛋白在转基因大米与亲本大米中表达情况，本论文利用酶联免疫吸附实验（ELISA）和免疫印迹杂交方法（western blot）两种方法对大米表达的Bt蛋白进行检测。免疫印迹杂交方法将样品与Bt标准品进行电泳，通过特异性的Bt蛋白一抗孵育，实验结果表明转Bt基因大米中存在与标准品分子量大小基本一致的条带(约66kD)，而亲本大米中没有检测到这个条带，说明转Bt基因大米中存在Bt蛋白表达，而亲本大米中没有Bt蛋白表达，表明本研究的关键样品材料是符合实验分析要求的。　　（4）大米差异蛋白质组学研究　　为探究转基因大米蛋白质组学变化，本论文选用转Bt水稻“华恢1号”与其亲本大米“明恢63”为研究对象，利用TCA-丙酮沉淀法提取大米总蛋白，应用蛋白质组学的研究方法比较水稻种子的蛋白质组表达谱，筛选出28个显著差异蛋白点（18个在转基因大米中表达上调，10个在转基因大米中表达下调），用改进的银染蛋白质胶内酶解方法酶切后进行质谱鉴定。所得质谱鉴定结果通过MASCOT数据库中检索；并利用DAVID Bioinformatics Resources6.7数据库进行基因本体论分析（gene ontology analysis）。对其生物学过程（Biological process）进行生物学功能注释，结果发现部分差异蛋白质（19个）主要参与能量代谢，蛋白质合成、氧化还原和应激响应等生物过程，表明生物学功能方面的差异可能是转Bt基因大米和亲本大米的蛋白质组的主要差异。有部分差异蛋白质（9个）在数据库中检索不到其生物过程功能，仅以序列号形式存在，没有功能注释，可能是由于这部分蛋白质目前仍认为没有重要的生物学功能而不被数据库收录。　　实验结果表明，转基因大米与其相应亲本大米表达的蛋白质组存在一定差异，但未发现其中的差异蛋白质具有抗营养性和致敏性，也未发现新蛋白或毒蛋白的产生，说明外源基因（cry1Ab/1Ac）的转入并不会引起转Bt基因大米的表达蛋白质组和大米营养成分的明显变化。生物信息学分析发现转Bt基因大米中的差异蛋白质主要参与糖代谢，蛋白质合成，氧化还原，应激响应等生物功能。转基因大米及其亲本大米在相同种植条件下蛋白质的变化，主要体现在转基因大米抗氧化抗逆性糖代谢相关蛋白相较亲本表达上调，甲硫氨酸合成酶表达量上调，这提示转基因株系能够通过保护系统更能适应不良环境影响。