猪圆环病毒3型（PCV3）是一种与急性猪皮炎和肾病综合征病（PDNS）样临床症状相关的新型圆环病毒,通过对病原进行宏基因组测序鉴定得到,病毒基因组大小为2000 bp,属于圆环病毒科,圆环病毒属。自从发现PCV3以来,该病毒已在世界范围内的家猪中报道,与其感染相关的临床和病理表现被认为包括PDNS、繁殖障碍、腹泻、全身性炎症、呼吸系统疾病和中枢神经系统疾病。PCV3的高发病率可能会对全球养猪业构成潜在威胁,但致使PCV3出现和传播的原因仍然不得而知,病毒的分离培养也是进行深入研究的一道极难跨过的门槛。目前针对PCV3的防控仍然是个难题,获得PCV3毒株是制备相关疫苗和开发相应抗病毒药物的关键。本研究应用圆环病毒反向遗传技术构建PCV3感染性克隆质粒,通过体内和体外两种方式进行病毒拯救研究,并对PCV3 Cap蛋白原核表达的条件进行了优化,以期为PCV3病原学、致病机理、新型疫苗等研究奠定基础。主要研究内容如下:1、PCV3感染性克隆质粒的构建与病毒拯救为获得PCV3拯救毒株,便于后续病毒的深入研究,本实验在PCV3环状基因组中选取了两个较为优异的开环位点,设计两对特异性引物,从PCV3阳性病料中扩增病毒基因组,将其克隆至pMD19-T Simple Vector构建重组质粒,双酶切目的片段后定向亚克隆至pcDNA3.1（+）真核表达载体,经测序鉴定成功构建了pcDNA3.1（+）-PCV3感染性克隆质粒。将该感染性克隆质粒经磷酸钙介导转染PK-15细胞,72 h后提取转染细胞总RNA,RT-PCR检测结果表明转染细胞中存在PCV3 Cap基因的转录。同时,将转染细胞按同步接毒和常规接毒分别进行传代培养,收毒后提取细胞毒液核酸,进行PCV3 ORF2基因的PCR检测。结果表明,同步接毒的1～4代细胞毒液中均可检测到大小为645 bp的目的条带,第4代以后的检测结果均为阴性。常规接毒,仅能在第1代和第2代细胞毒液中检测到较弱的目的条带。为进一步评估该PCV3感染性克隆质粒在昆明小鼠体内的是否具有感染性,实验将10只小鼠随机分为两组,实验组每只小鼠肌肉注射200μg pcDNA3.1（+）-PCV3感染性克隆质粒,对照组每只小鼠肌肉注射200 m L生理盐水,分别于接种后第7d、14d、21d、28d断尾采血,取血清检测PCV3病毒血症持续时间。结果显示,4只实验组昆明小鼠在7d时即可检测到病毒血症,病毒血症最长可持续到第21 d。为进一步验证拯救病毒的感染性,将检测为阳性的第7 d的小鼠血清同步接种PK-15细胞,连续传代培养,并对每一代细胞毒液进行Cap基因的PCR检测,结果表明经小鼠拯救的PCV3,可在PK-15细胞中增殖,但增殖能力较弱,连续传代至第8代后,Cap基因PCR检测结果为阴性。研究结果表明,实验构建的pcDNA3.1（+）-PCV3感染性克隆质粒对PK-15细胞和小鼠均具有感染性,经转染或小鼠体内拯救均可获得PCV3拯救病毒。然而,PCV3拯救病毒在PK-15细胞中的传代增殖能力弱,不适合PK-15细胞的常规接毒培养,病毒增殖传代方法尚需进一步研究优化。2、猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达优化为对PCV3拯救病毒的鉴定结果进行验证,需要制备抗PCV3单克隆抗体。目前本实验室制备的PCV3 Cap蛋白主要以包涵体的形式进行表达,虽然表达量高,但包涵体纯化的工作较为繁琐,为抗体的制备带来了一定的难度。为获得可高效表达的PCV3可溶性Cap蛋白,实验对已构建的pET-32a（+）-PCV3-Cap原核表达质粒进行了诱导条件的优化研究。在原有条件为IPTG终浓度1 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间4 h的基础上,参考其他文献报道,通过降低诱导表达温度,减少IPTG的使用量进行了优化研究;融合表达蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳,应用His标签抗体进行了Western blot检验验证。结果表明,在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、诱导温度为20℃,诱导时间为20 h的最佳条件下,可获得高效表达的PCV3可溶性Cap蛋白。本研究为PCV3抗体的制备,血清学鉴别诊断方法的建立,以及基因工程亚单位疫苗的开发等奠定了一定的研究基础。