麝香对颅骨骨缺损模型大鼠修复作用及机制研究

来源 :甘肃中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiaohan52132500
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目的:通过制备麝香含药血清诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨分化和建立大鼠颅骨骨缺损模型的方法,观察骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)及成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF-2)在颅骨骨缺损愈合过程中的表达变化,探索麝香促进骨缺损愈合的机制。方法:利用SD大鼠提取BMSCs,培养至第二代进行细胞形态学观察、细胞表型检测及成骨诱导,鉴定培养BMSCs成功后,麝香含药血清干预第二代BMSCs,分别于第7,14,28天采用蛋白印迹法检测BMP-2、FGF-2在BMSCs成骨诱导分化过程中的表达;建立大鼠颅骨骨缺损模型,采用随机数字表法分为模型组和实验组,每组150只,实验组按照42 mg·kg-1的比例给予天然麝香灌胃,模型组灌服等体积的0.9%生理盐水,均每日1次,分别于灌胃后第7,14,28天采用蛋白印迹法检测BMP-2、FGF-2在骨缺损处的表达。结果:(1)BMSCs的形态学观察:刚接种时的BMSCs与血细胞或其他细胞混合无法分辨,培养液浑浊,细胞形态以大小不等的圆形、椭圆形或不规则形状等为主,悬浮于培养液中;接种培养2天后,可见少量细胞开始贴壁,胞体呈扁长形或多边形,视野模糊,生长缓慢;培养至第4天,大量细胞开始贴壁,部分细胞呈梭形或纺锤状生长,杂细胞明显减少,视野清楚;培养至第8天,细胞分裂速度明显较前期加快,细胞体积增大,分裂增殖旺盛,并成漩涡状排列,贴壁细胞长满瓶底达80%以上;原代BMSCs传至第1代后得到纯化,培养2天后细胞开始大量贴壁,细胞体积较小,形状以短梭形为主,可见少量不规则形状;培养至第4天时,细胞生长速度明显加快,已经铺满整个瓶底,多层排列,细胞呈梭形,出现细胞集落群,融合成片,杂质较少;第1代传至第2代后细胞得到进一步纯化,传代后约6 h细胞开始贴壁,细胞体积显著增大;培养至第3天,细胞融合达70%以上,排列规则,细胞形态较一致,少量细胞呈老化趋势,核浆比例增大;培养至第5天,细胞排列紧密,呈漩祸状生长,已经铺满瓶底,几乎无杂细胞,但可见少量老化细胞。(2)BMSCs的表型检测:第2代BMSCs表面标志物CD90表达率为93.5%,呈强阳性;CD45表达率为0.0%,呈阴性。(3)BMSCs的成骨诱导:成骨诱导10天后,细胞逐渐出现叠层、片状生长趋势,部分细胞的形态由梭形转变为三角形或不规则形状,经茜素红转染后,可见散在砂粒样的深红色钙化结节;成骨诱导14天后,细胞密度和钙化结节逐渐增多,细胞聚集成团块状,茜素红转染后的钙化结节呈深红色或黑红色。(4)BMP-2、FGF-2在BMSCs成骨诱导中的表达:BMP-2麝香组第7,14天高于空白组及同组第28天的表达,差异均有统计学意义(均P<0.05),第14天的表达高于成骨诱导组,差异有统计学意义(P<0.05),成骨诱导组第14天高于空白组及同组第28的表达,差异均有统计学意义(均P<0.05);FGF-2麝香组第14天的表达高于空白组,第7天的表达高于本组第28天,差异均有统计学意义(均P<0.05),成骨诱导组第14天的表达高于空白组及麝香组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。(5)颅骨骨缺损处的愈合情况:造模后第7天取材,见圆形骨缺损不同程度愈合,实验组愈合优于模型组;第14天实验组隐约可见圆形缺损,而模型组的骨缺损与正常骨组织边界较为明显;第28天时,实验组几乎完全愈合,圆形缺损与周围正常骨组织的界限模糊,模型组圆形缺损可见,但愈合程度优于第14天。(6)BMP-2、FGF-2在颅骨骨缺损处的表达:实验组BMP-2在第7天的表达达到峰值,第14天时降低,第28天时表达最低;FGF-2在第14天的表达达到峰值(P<0.05),第7天时降低,第28天时表达最低;与模型组比较,实验组第7天BMP-2的表达,差异有统计学意义(P<0.05),第7,14天FGF-2的表达,差异均有统计学意义(均P<0.05);实验组第14天FGF-2的表达高于同组第28天,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:麝香能促进大鼠颅骨骨缺损的愈合,其机制与BMP-2和FGF-2的表达有关。
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