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背景与目的： 急性脑缺血事件极其常见，致残、致死率高，目前尚无确实有效的神经保护剂用于临床治疗。近年的研究表明短暂全脑缺血(Transient global cerebral ischemia,tGCI)后，机体会启动相应的耐受机制，使其对后续发生的严重的甚至致死性的缺血产生耐受，从而起神经保护作用，这一过程叫缺血耐受或缺血预处理。低氧预处理(Hypoxia preconditioning,HPC)作为一种无创的干预，在实验研究中受到重视，并被反复证实。2010年课题组在《J.Neurochem.》上首先报道了成年雄性Wistar大鼠短暂全脑缺血10min前1-4d内给予成分为(8%O2+92%N2)持续30-120min的低氧预处理，可使后续发生的短暂全脑缺血所致的海马CA1区神经元死亡减少。缺血前1d给予30min的低氧预处理所产生的神经保护作用最显著。对于一些可预测、可控制的急性脑缺血临床事件，低氧预处理可能减轻这些临床事件所引起的神经损伤。脑缺血后自噬体集聚与神经元变性死亡有关。缺血、外伤等引起的自噬成熟障碍均能导致自噬体集聚，在自噬成熟中激活的Rab7发挥重要作用。低氧预处理能否通过促进自噬成熟发挥神经保护作用，目前研究的证据不多。本研究拟在成年大鼠低氧预处理-短暂全脑缺血模型中，通过免疫印迹、免疫共沉淀、免疫组化、激光共聚焦显微镜等技术，探讨tGCI后大鼠海马CA1区中自噬体集聚是否由自噬成熟障碍引起，低氧预处理是否通过上调海马CA1区UVRAG表达量，促进C-Vps复合物激活Rab7，从而增加tGCI后海马CA1区自噬通量，促进自噬成熟，发挥神经保护作用。 材料与方法： 本研究选用体重220～280g的成年雄性Wistar大鼠。短暂全脑缺血模型制作采用改良的Pulsinelli经典四血管闭塞的方法。在大鼠短暂全脑缺血10min前1d将大鼠放入密闭防潮箱内，并连续通入8%O2+92%N2混合气体，给予30min低氧预处理。运用免疫印迹、免疫组化、免疫荧光等方法分别观察假手术（Sham）组、短暂全脑缺血（tGCI）组及低氧预处理+短暂全脑缺血（HPC）组LC3、Cathepsin D、Rab7、UVRAG的表达变化。采用免疫共沉淀观察Sham组、tGCI组及HPC组Rab7-RILP及Rab7-Vps16的相互作用。应用尼氏染色、NeuN免疫组化与Fluoro-Jade B染色检测氯喹及抑胃酶肽A对低氧预处理-短暂全脑缺血后海马CA1区神经元的影响。 结果： 1.Western blotting结果显示：与Sham组比较，大鼠海马CA1区LC3Ⅱ/Ⅰ在tGCI后0h、4h、24h、48h明显升高（p＜0.05），48h达高峰；与tGCI组比较，与tGCI对应时间点的HPC组，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显降低（p＜0.05）。 2.与Sham组比较，tGCI0h及HPC0h组的大鼠海马CA1区Cathepsin D表达增多（p＜0.05），且HPC组高于tGCI组（p＜0.05）；HPC前经腹腔注射抑胃酶肽A（PA）后，PA可以使HPC0h组的Cathepsin D表达量明显降低（p＜0.05），而与HPC7d组比较，PA+HPC7d组海马CA1区存活的神经元、变性神经元数目则无明显变化。 3.与Sham组比较，tGCI7d组的大鼠海马CA1区存活神经元显著减少，变性神经元明显增多（p＜0.05）；与tGCI组比较，HPC7d组存活神经元增多，变性神经元减少（p＜0.05）；与HPC组比较，HPC前2h经腹腔注射氯喹，可以使tGCI后7d海马CA1区存活的神经元显著减少，变性神经元增多（p＜0.05）。 4.Western blotting结果显示：与Sham组比较，HPC24h组的大鼠海马CA1区Rab7显著升高（p＜0.05），tGCI组和其他HPC组无明显变化（p＞0.05）。免疫共沉淀结果显示，Rab7与RILP在Sham组、tGCI组和HPC组均有相互作用，HPC0h、4h与24h组Rab7-RILP的相互作用较同一时间点的tGCI组明显增强。Rab7免疫荧光双标的结果显示，Rab7在星形胶质细胞表达，在小胶质细胞无表达；在海马CA3区Rab7在星形胶质细胞及小胶质细胞均无表达。 5.免疫共沉淀结果显示：与Sham组相比，Rab7与Vps16的相互作用在tGCI0h、4h组明显减弱，给予HPC后两者相互作用明显增强。Western blotting结果显示：与Sham组比较，tGCI0h、4h及48h组海马CA1区UVRAG蛋白表达量均降低，（p＜0.05）。HPC0h、4h组蛋白表达量高于对应的tGCI组（p＜0.05）。 结论： 在成年Wistar大鼠短暂全脑缺血后，自噬成熟障碍导致海马CA1区神经元死亡；低氧预处理通过上调海马CA1区UVRAG表达量，促使C-Vps复合物激活Rab7，促进自噬成熟，发挥神经保护作用。