5-4A是我所研制的新维甲类化合物。本文就其对肿瘤细胞的分化诱导作用，抗肿瘤，抗侵袭作用及其作用原理进行了系统的研究。结果表明，5-4A对人急性早幼粒白血病细胞具有明显的分化诱导作用，5-4A在10^-6mol／L浓度即可明显抑制HL-60细胞的生长及克隆形成，并使细胞的NBT还原能力，酸性磷酸酶活力及吞噬活力显著提高。5-4A在10^-6mol／L浓度下，作用6天可使NBT阳性细胞数达90％以上。细胞形态向成熟方向分化，镜下可见大量中、晚幼细胞及一些杆状核及分叶核细胞。电镜下，细胞核不规则，核仁消失，核浆比例变小，线粒体增多。经5-4A处理的HL-60细胞，其中性粒细胞特异性酯酶-酸性醋酸脂酶染色呈阳性反应，表明它向粒系方向分化。5-4A对单核细胞白血病U937细胞也具有分化诱导作用，5-4A 10^-5mol／L可显著抑制U937细胞生长。NBT还原能力，酸性醋酸酯酶活性及吞噬能力也显著提高。细胞形态向单核-巨噬细胞分化。5-4A 10^-5mol／L作用6天，可使80％的U937细胞分化为单核-巨噬细胞，细胞变大，核变小，核浆比例缩小，胞浆染色浅。流式细胞分析表明，5-4A 10^-5mol／L作用6天，可阻止U937细胞由G1期向S期移行，使70％细胞停止在G1期。5-4A还对肝癌Be17402细胞有分化诱导作用，5-4A在5x10^-5mol／L浓度下可抑制Be17402细胞生长及克隆形成。5-4A处理4-6天后，与肝癌恶性程度相关的指标：甲胎球蛋白及r-GT含量显著降低；而分化指标：白蛋白显著升高。形态变化显著，5-4A 5x10^-5作用4天，即可见核浆比例缩小。电镜下，核变小，核浆比例增大，线粒体，内质网及微绒毛增多。5-4A对移植性大鼠软骨肉瘤具有很强的抑制作用。20mg／Kg，口服给药20天，可完全抑制肿瘤的生长。在体外，用MTT法观察5-4A对Be17402，B16，KB，3T3等细胞作用，发现其EC₅₀在10^-4mol／L浓度以上，说明5-4A没有细胞毒作用。测定5-4A小鼠急性毒性，发现其LD₅₀为3.81g／Kg，显著低于维甲酸。作用选择性研究发现，5-4A 10^-5mol／L对HL-60细胞软琼脂集落形成抑制作用显著，但对骨髓细胞CFU-GM集落形成无明显影响。说明5-4A对肿瘤细胞具有较高的选择作用。5-4A还对黑色素瘤高转移株B16-BL6细胞具有抗侵袭作用。5-4A 8x10^-5mol／L可使侵袭抑制率达70％。对B16-BL6运动能力也有抑制作用。观察5-4A对HT1080与侵袭能力相关的Ⅳ型胶原酶的影响，发现在5-4A 10^-5-10^-7mol／L浓度下作用3天，可明显抑制Ⅳ型胶原酶活力。研究还证明，5-4A能诱导HL-60细胞产生程序性死亡。5-4A(10^-6-10^-8mol／L)作用5天，可使细胞核固缩，核碎裂并出现凋亡小体。DNA琼脂糖凝胶电泳呈典型的DNA梯状，用流式细胞仪进行细胞动力学研究可见，在G1峰前面出现一个DNA含量较少的“G1亚峰”。Dot blot结果表明，5-4A(10^-6mol／L)处理HL-60细胞24小时后，使细胞内bcl-Ⅱ基因表达显著降低。机理研究发现，RARs及RXRs在HL-60细胞中均有一定的表达。5-4A作用后的HL-60细胞，RXR表达水平无显著变化。RARs各亚型表达水平变化不一样，其中RARβ表达水平升高最为明显，RARγ次之，RARα表达水平无变化。用基因重组技术将人维甲酸受体导人大肠杆菌并使其表达，提取RARα受体蛋白进行受体配体结合试验发现，5-4A与维甲酸一样具有与维甲酸受体结合活性，但结合活性低于维甲酸。观察5-4A对HL-60抗性细胞株HL-60／RA作用发现5-4A与RA同样对HL-60／RA细胞无分化诱导作用。提示5-4A与全反式维甲酸有交叉耐药性也是通过维甲酸受体而发挥作用的。用Dot blot技术发现5-4A可在转录水平上调控某些基因的表达。5-4A 10^-6mol／L处理HL-6024小时，可使c-myc表达明显下降而c-fos表达显著提高。在Bel 7402细胞，5-4A 5x10^-5mol／L处理24小时，同样使c-myc表达降低，c-fos表达增强，从而证明5-4A通过维甲酸受体在转录水平调节参与细胞增殖分化基因的表达，而达到分化诱导作用。维甲类化合物对生物的生长发育及细胞的分化具有广泛的调控作用。一些肿瘤疾患，特别是白血病的分化诱导治疗，已取得举世注目的进展，分化诱导成为治疗白血病主要方法之一。近年研究发现，维甲类化合物是通过维甲酸受体而发挥作用的。因此，通过受体配体结合方法来筛选维甲类化合物成为分化诱导治疗取得突破的关键因素。由于维甲酸受体在细胞内丰度很低，而且真核细胞中成份复杂，很难提取到一定量的，高纯度的维甲酸受体供研究或筛选之用。因此，用基因工程方法通过原核细胞大肠杆菌来生产维甲酸受体是解决这一难题的有效途径之一。我们利用T7 RNA Promoter system将RARαcDNA定向地亚克隆至PT7-7质粒，构建了重组RARα表达质粒PT7-RARα，并在大肠杆菌中得到了稳定的表达。序列分析证实，RARα序列及在PT7-7上的亚克隆位点，与文献报导一致。Western blotting检测，在分子量为53.0KDa处出现一特异的条带。将菌体提取物，用活性碳吸附法，可检测出其与维甲酸的结合活性。通过受体结合饱和试验（Scatchard分析），我们挑选了五种生物活性不同的维甲类化合物，分别对它们的受体结合能力及对急性早幼粒白血病HL-60细胞分化诱导能力进行了相关性研究。结果表明，这类化合物的维甲酸受体结合能力与其诱导HL-60细胞成熟分化能力成正相关。人重组维甲酸受体及其生物活性相关性研究，不仅证明维甲类化合物通过维甲酸受体发挥作用，而且在分子水平上为寻找新分化诱导药提供了一个有力的工具。