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本论文通过反向遗传学、分子生理生化等手段研究了亲环蛋白基因CYP20-2在拟南芥和水稻中的功能。 植物亲环蛋白家族(eyclophilin,CYP)是能够与免疫抑制剂环孢霉素A(cyclosporineA,CsA)特异结合的一个较大的蛋白家族,其具有肽脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-proly1 cis-trans-isomerase,PPIase)活性,能够催化脯氨酸肽键(Xaa-Pro)的顺反异构化,进而参与对植物体生长发育的调节、代谢调控以及对逆境的应答等。对更多CYP功能的研究可以发现这个家族成员的新功能。AtCYP20-2超表达转基因株系在长日照和短日照条件下均呈现开花提前的表型。PPIase活性测定表明AtCYP20-2具有肽脯氨酰顺反异构酶活性。Pull-down实验和CoIP实验表明AtCYP20-2可以与油菜素内酯信号途径重要的转录因子BZR1互作。傅里叶变换红外光谱测定实验表明,AtCYP20-2可以改变BZR1蛋白二级结构构象。 BZR1获得性突变体bzr1-1D和mx3(pBZR1∷mBZR1Pro234-Leu-CFP)转基因植株均呈现晚花的表型。AtCYP20-2超表达株系可以部分恢复mx3的晚花表型,western blot检测发现杂交株系中BZR1总蛋白水平减少,并且BZR1蛋白非磷酸化形式比磷酸化形式少,暗示CYP20-2可以促进BZR1蛋白向磷酸化形式转变,进而促进其降解。为了更进一步研究BZR1调控开花的分子机理,我们利用生物信息学于段在目前已经报道的174个开花基因的启动子区筛选BR响应元件(BR response element,BRRE),然后利用定量PCR对筛选到的候选基因在mx3中的表达量分析发现,开花正调控因子FLD表达量明显下调。凝胶阻滞(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)、染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation assay,ChIP)和瞬时系统转录活性测定实验表明BZR1可以结合FLD的启动子,并且负调控FLD的转录。为了更进一步从遗传上证明BZR1和FLD的关系,我们构建了35S∷FLD重组载体,并且将其转化mx3,表型观察发现35S∷FLD可以部分恢复mx3的晚花表型,这从遗传上说明FLD的确位于BZR1下游。FLD是一个组蛋白去甲基酶,AtCYP20-2超表达株系中组蛋白H3K4me3和H3乙酰化总体水平明显降低,ChIP实验表明FLC染色质位点上的修饰也明显减少;在mx3中组蛋白H3K4me3和H3乙酰化总体水平明显增加,ChIP实验发现FLC染色质位点上的修饰也明显增加,这些结果说明FLD转录水平与FLC位点上组蛋白修饰水平呈现负相关。综合以上结论说明,亲环蛋白AtCYP20-2可以改变BZR1的二级结构构象,进而促进其降解,BZR1负调控FLD的转录,从而调控拟南芥开花。 水稻理想株型被认为应该具有矮化和直立叶片的性状,这有利于植物利用光能和抗倒伏,从而增加产量。叶片向近轴面卷曲能导致水稻产生直立的性状,这对于改良水稻株型非常重要。本论文发现一个新的矮化并且叶片上卷的水稻突变体,该突变体是由于T-DNA插入到亲环蛋白基因OsCYP20-2的第一个intron区引起的。通过在微分干涉相差显微镜下观察野生型和突变体第二叶鞘表皮细胞发现,突变体中第二叶鞘表皮细胞的长度与野生型相比明显减小,说明突变体的矮化可能是由于细胞伸长受阻造成的。共分离实验表明oscyp20-2突变体是单基因隐性突变引起的,同时pOsCYP20-2∷OsCYP20-2重组质粒可以互补oscyp20-2突变体的表型。OsCYP20-2在各个组织中呈现组成型表达,在叶片中表达量最高,原位杂交实验表明OsCYP20-2在叶片背腹面均有表达。OsCYP20-2主要定位于叶绿体,但是我们发现在细胞核中存在其一个分子量略小的剪切体。第二叶鞘伸长实验和α-淀粉酶活性实验表明oscyp20-2突变体对赤霉素敏感性减弱;根伸长抑制实验、叶夹角实验和暗下中胚轴长度观察发现oscyp20-2突变体对油菜素内酯的敏感性降低。酵母双杂交筛选OsCYP20-2互作蛋白时,我们发现DELLA蛋白是其作用的靶蛋白,同时也发现SLR1可以和OsBZR1互作。Pull-down和BiFC实验进一步验证了OsCYP20-2缺失信号肽的部分可以和SLR1在细胞核内互作,SLR1与OsBZR1也在细胞核内互作。PPIase活性测定实验表明,OsCYP20-2具有肽脯氨酰顺反异构酶活性,傅里叶变换红外光谱测定实验表明OsCYP20-2可以改变SLR1蛋白的二级结构构象。Western blot实验表明oscyp20-2突变体中SLR1蛋白得到累积,但是OsBZR1蛋白水平并没有发生改变,暗示OsCYP20-2可能正调控SLR1蛋白的降解过程。SLR1超表达的转基因株系呈现与oscyp20-2突变体类似的矮化表型。ChIP实验和瞬时系统转录活性测定实验表明SLR1可以抑制OsBZR1对DNA的结合能力,从而抑制其对下游基因的调控。综合以上结论说明,OsCYP20-2与SLR1蛋白互作并且改变其构象,从而正调控SLR1蛋白的降解过程,SLR1与OsBZR1蛋白直接互作抑制其对下游基因的转录调控,因此OsCYP20-2通过介导GA和BR信号从而调控水稻株高。