磁固相萃取与纳米金比色法在蛋白富集和检测方面的应用

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磁固相萃取(Magnetic Solid Phase Extraction,MSPE)技术在分离富集领域得到广泛发展。MSPE技术是基于液-固相色谱理论,其核心结构是磁性微纳米颗粒,容易分散到样品基质当中,并将待分析目标物吸附到磁性材料表面,由于磁性吸附剂在磁场中具有强烈响应,所以通过施加外部磁场能够将目标物随吸附剂一起从液体或者悬浮液中分离开来,实现富集、分离与回收同步,整个实验过程简单快速,避免了繁琐的过滤或离心操作,能够轻易达到分离富集目标物的目的。  纳米金(AuNPs)比色法通过待检测物质与AuNPs之间直接或者间接的相互作用,引起颜色的改变而对目标物进行检测。该检测方法不需要大型仪器或复杂设备,AuNPs作为化学及生物检测分析中的指示剂和传感器可应用于环境污染物、食品药品中有害物质的快速检测。  在本研究论文中,(1)通过层层包覆的方法合成Ti4+-PDA@Fe3O4磁粒,并通过TEM、SEM、VSM、EDX等对其进行表征,结果表明该磁粒具有比较均一的形状和尺寸,在水溶液中具有良好的分散性和磁响应性。Ti4+-PDA@Fe3O4磁粒表面上的Ti4+能够与磷酸化蛋白上的磷酸基团发生强烈的亲和作用,所以Ti4+-PDA@Fe3O4磁粒能够高效和特异性吸附磷酸化蛋白。Ti4+-PDA@Fe3O4磁粒对β-Cas的吸附容量达到1273.9 mg g-1,与其他同类材料对比发现Ti4+-PDA@Fe3O4磁粒对β-Cas的吸附具有很大优势。另外,我们使用Ti4+-PDA@Fe3O4磁粒成功的从牛奶中提取出较高纯度的磷酸化蛋白。因此,Ti4+-PDA@Fe3O4磁粒能够提取复杂样品中磷酸化蛋白,在探究磷酸化蛋白的结构、功能等方面具有潜在的应用价值。  (2)在Fe3O4-COOH磁粒表面包覆PDA的反应液中加入EG,可以使PDA膜粗糙化,进一步修饰上Ti4+得到具有粗糙表面的Ti4+-rPDA@Fe3O4磁粒。所制备的Ti4+-rPDA@Fe3O4磁粒上的Ti4+对单磷酸化蛋白上的磷酸基团具有好的特异性,对κ-Cas的最大吸附容量为1105.6 mg g-1。我们使用所制各的磁粒对磷酸化肽进行了富集,结合CE进行分析,结果表明Ti4+-rPDA@Fe3O4磁粒对磷酸化肽表现出优良的特异性。另外,我们用Ti4+-rPDA@Fe3O4磁粒从牛奶样品成功地分离出较高纯度的磷酸化蛋白。  (3)使用30 nm AuNPs通过比色法对Lyz实现快速检测。在碱性条件下(20mM PBS,pH10.0)带负电的AuNPs能够与带正电的Lyz通过静电作用诱导AuNPs发生聚集,使其颜色由红色变为蓝色。在pH10.0条件下,AuNPs对Lyz表现出良好的选择性。该方法无需对AuNPs进行进一步的修饰,而且不需要加入其它的诱导剂,与已报道的AuNPs比色法检测Lyz进行相比更加简单快速。该方法与磁固相萃取方法相结合并成功用于检测蛋清中的Lyz。
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