研究背景和意义:原发性瓣膜功能不全、血栓形成完全再通后的瓣膜破坏以及先天性瓣膜缺乏等静脉疾患,静脉瓣移植常常是最后的选择。但是,自体静脉瓣移植除来源有限、损伤较大外,尚有瓣膜强度不足和带瓣静脉的管径往往难以符合要求等问题。近年来,心血管组织工程技术的发展为构建组织工程化静脉瓣膜提供了可能。研究证明,虽然每条深静脉的瓣膜有多对,但只要移植一对有功能的瓣膜就能明显改善血液逆流的问题,这就使得构建组织工程化静脉瓣更具有实用价值。因此应用细胞生物学与工程学原理开发出具有生物活性、无免疫原性的组织工程化静脉瓣是修复与功能重建深静脉功能不全的理想方案。目前组织工程化静脉瓣的研究国外尚处于起步阶段,国内也仅我们研究所在进行该项研究。Pavcnik等采用金属架支撑的去细胞异体小肠黏膜下层(SIS)作为静脉瓣膜移植物经皮送至绵羊股静脉,1个月后可见到受体绵羊的内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞成分黏附并进入到移植物内部及表面生长,移植物具有类似自体瓣膜的功能;但是由于没有种植细胞和进行再内皮化,虽然采用了肝素抗凝,部分移植物还是出现了出血、血栓、钙化等严重并发症。可见,未种植细胞的瓣膜支架材料体内种植不是瓣膜移植的理想选择。Teebken等应用组织工程学原理,采用同种异体去细胞绵羊带瓣静脉作为支架,在其上种植受体绵羊静脉壁来源的肌纤维母细胞和内皮细胞构建组织工程化静脉瓣,但是肌纤维母细胞没能长入支架内部,移植到受体绵羊股静脉后,虽然短期内多数移植瓣膜有功能,但12周时半数组织工程化静脉瓣失去功能,这可能与种植细胞的活性及寿命有关。2008年,本研究所温昱博士进行了“犬MAPCs/EPCs性组织工程化静脉瓣应用基础”的研究工作,其研究结果显示,犬MAPCs/EPCs性组织工程化静脉瓣3个月时在颈外静脉内均能发挥静脉瓣生理功能,但和正常静脉瓣相比功能出现了一定程度上的减弱。原因可能是在种子细胞EPC在种植时只进行了顺血流方向种植和培养,而没有采用逆血流方向种植的缘故。另外,该研究将组织工程化静脉瓣移植到犬的颈外静脉仅进行了在体3个月的效用性研究,因颈外静脉和下肢静脉血液回流有很大的不同,所以在即使其在3个月时有一定的生理功能,也不能真正说明组织工程化静脉瓣在下肢长期生理功能问题。除此之外,本研究所前期还进行了自体MAPC和EPC细胞、异种脱细胞支架性组织工程化静脉瓣在体安全性评价研究,结果显示用自体骨髓来源的MAPC、EPC和同种异体脱细胞支架一起构建的组织工程化静脉瓣在受体动物体内没有免疫排斥反应,没有毒性,能与宿主很好的共存,说明用受体骨髓来源的MAPC和EPC种植在同种异体脱细胞支架材料上构建的组织工程化静脉瓣可安全应用于临床。至今为止,组织工程化静脉瓣的研究已取得了不小的进展,但还有很多问题亟需解决。为此,本课题拟采用同种异体脱细胞绵羊静脉瓣作为支架,联合应用多点注射、加压灌注等技术,分批种植受体绵羊自体骨髓来源的成体多能祖细胞(Multipotent adult progenitor cells,MAPC)和内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPC),体外构建“绵羊MAPCs/EPCs性组织工程化静脉瓣”,并将其吻接于受体绵羊股静脉处,进行长时程(为期1年)在体观察,采用彩色多谱勒超声仪、小动物超声仪、数字减影成像仪进行效用性研究,不同时间段取材后作大体观察并运用HE染色、免疫组织化学染色、扫描电镜、透射电镜来检测种子细胞在支架材料上的分布、生长、分化演变情况,拟研制一种具有临床应用前景的组织工程化静脉瓣。第一部分MAPCs/EPCs性组织工程化静脉瓣的构建研究目的:通过多点注射和加压灌注的方法,将受体绵羊骨髓来源的MAPC和EPC,分批种植于绵羊同种异体脱细胞带瓣静脉支架上,体外培养构建组织工程化静脉瓣。材料和方法:绵羊髂后上棘抽取骨髓,MAPC和EPC的原代培养、传代,分选CD45-的MAPC和CD133+的EPC,流式检测MAPC的SSEA-1、EPC的CD133和CD14;以GADPH为内参, RT-PCR检测MAPC的OCT-4、SM-MHC和EPC的KDR、VE-cadherin等标记分子;用免疫细胞荧光化学检测MAPC的CD13、SSEA-1、CD44、CD45、MHC-‖和EPC的CD133、CD14、VWF、CD31。0.5%Triton-100+0.05%NH4OH进行同种异体带瓣静脉支架脱细胞处理, DNase+RNase消化支架内酶, HE染色和van Gieson染色分别观察脱细胞情况、弹力纤维和胶原纤维的分布。分选扩增后的MAPC用Hochest标记、EPC用PKH26标记,应用多点注射和加压灌注的方法分批种植在脱细胞支架上,构建MAPCs/EPCs性组织工程化静脉瓣。体外培养不同时间的组织工程化静脉瓣行冰冻切片,荧光显微镜下观察种子细胞MAPC和EPC在支架材料上的生长和迁移。用上述方法将未标记的绵羊MAPC和EPC扩增后采用相同构建方法体外构建绵羊组织工程化静脉瓣。组织工程化静脉瓣、脱细胞支架、天然静脉,弹性回复实验检测三组血管的弹性断裂强度差异;扫描电镜检测组织工程化静脉瓣血管壁细胞与天然血管壁细胞分布差异。组织工程化静脉瓣行石蜡包埋、切片, HE染色和Desmin、α-actin、VWF、VEGF、CD133免疫组化分子检测,观察种子细胞在支架材料上的分布、分化及内皮化情况。结果: CD45-的MAPC和CD133+的EPC细胞形态较均一,呈三角形或长梭形,折光性强,增殖旺盛,融合后均呈铺路石样排列。流式细胞仪检测显示:MAPC的SSEA-1阳性率为31.47%;EPC的CD14阳性率为50.26%、CD133阳性率为92.39%;细胞免疫荧光染色结果显示:MAPC为CD13+、SSEA-1+、CD44-、CD45-、CD133-、MHCⅡ-;EPC表达CD133、CD14,不表达CD45。RT-PCR结果显示:MAPC表达OCT-4、SM-MHC分子;EPC表达KDR、VE-cadherin分子。Hochest和PKH26能成功标记两种细胞,显微镜下能观察到MAPC和EPC分别发蓝光和红光,构建血管后冰冻切片荧光显微镜观察,可显示标记的种子细胞能成功种植在脱细胞支架上,并在血管内壁和瓣膜两侧生长形成细胞单层。构建血管与天然血管相比:在扫描电镜下内壁细胞分布相似;弹性断裂强度,构建血管和天然血管差异不明显,和脱细胞支架有显著性差异。HE染色显示脱细胞支架没有残留细胞,天然血管细胞排列整齐,组织工程化静脉瓣内壁和瓣膜两面有单层细胞。Van Gieson染色显示脱细胞支架、构建血管和天然血管弹力纤维和胶原纤维分布相似。组织工程化静脉瓣免疫组织化学染色显示:Desmin、α-actin、VWF、VEGF、CD133均呈阳性表达。结论:以绵羊自体骨髓MAPC和EPC为种子细胞,以同种异体脱细胞带瓣静脉为支架材料,应用多点注射和加压灌注等方法,体外可以成功构建组织工程化静脉瓣。第二部分MAPCs/EPCs性组织工程化静脉瓣的在体研究研究目的:MAPCs/EPCs性组织工程化静脉瓣体内移植,研究其功能和体内演变规律,探讨自体组织干细胞、脱细胞支架性组织工程化静脉瓣临床应用的可能性。材料和方法:雌性1 y龄绵羊12只,分3组,每组4只。将构建的含绵羊MAPCs/EPCs性组织工程化静脉瓣血管以端端吻合术吻接至受体绵羊右侧股静脉处作实验组。左侧移入同种异体脱细胞静脉瓣支架作对照组。术后3、6、12月时间点运用彩色多普勒超声仪、小动物超声以及数字减影血管造影(DSA)进行检测;并分别在3、6、12月时间点处死动物,取出移植物,大体观察后,4 %多聚甲醛固定,脱水、透明、石蜡包埋,制备石蜡切片,分别进行H-E染色及免疫组织化学染色,扫描电镜和透射电镜检测。结果:绵羊MAPCs/EPCs性组织工程化静脉瓣植入体内后在体检测:彩色超声多普勒显示通畅率实验组(对照组)分别为3个月4/4(4/4),6个月4/4(1/4),12个月1/4(0/4);术后3个月DSA检查实验组未见返流,对照组可见明显返流;术后6个月小动物超声检查实验组可见瓣膜回声,但是瓣膜运动受限,对照组静脉壁增厚,瓣膜形态分辨不清。大体、透射电镜、扫描电镜、组织学及免疫组织化学观察:术后3个月实验组未见血栓形成,静脉壁及瓣膜壁无明显增厚,形态与正常相似,内皮处及瓣膜上VE-cadherin、VWF和VEGFR阳性,中膜VE-cadherin、α-actin及Desmin阳性;对照组出现肉眼可见血栓,H-E染色为瓣膜处较大附壁血栓,内膜除表达VEGFR, VWF外,VE-cadherin、α-actin及Desmin也明显表达。术后6个月实验组瓣膜处见附壁血栓,但静脉壁无明显增厚,瓣膜形态清晰可辨,内膜VEGFR, VWF阳性,中膜α-actin及Desmin阳性;对照组静脉壁极度增厚至阻塞管腔,瓣膜结构被破坏,瓣膜形态分辨不清,血栓明显,VEGFR, VWF外,VE-cadherin、α-actin及Desmin均不表达。术后12个月时实验组瓣膜及静脉壁明显增厚,可见血栓,但瓣膜形态仍可辨,内膜VEGFR, VWF阳性,中膜VE-cadherin、α-actin及Desmin阳性;对照组瓣膜明显增厚似静脉壁,不能分清静脉壁三层结构,VEGFR, VWF外,VE-cadherin、α-actin及Desmin均不表达。。结论:MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣植入体内半年内具有一定瓣膜功能,但在一年时功能消失。可见在当前条件下构建的组织工程化静脉瓣在体内不能长时间发挥生理功能,需要进一步探索组织工程化静脉瓣的构建方法,改善组织工程化静脉瓣在体生理功能。