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研究目的Nance-Horan综合征(Nance-Horan syndrome, NHS)是一种罕见的x连锁遗传性疾病,其典型特征是先天性白内障、牙齿及颅面部异常。其中30%的患者有智力发育障碍。NHS基因是该综合征的致病基因。NHS基因包含10个外显子,通过选择性剪切编码至少6种蛋白异构体(亚型)。其中,NHS-A和NHS-1A是两种主要的亚型,两者均从NHS基因第一个外显子转录,前者编码一个长约1630个氨基酸的蛋白质,后者编码一个长约1651个氨基酸的蛋白质。在这两个蛋白亚型的N端有一个WAVE蛋白同源结构域(WHD),能够与Abelson-interactor (Abi)蛋白家族,如Abi1和Abi2等相互作用。研究显示NHS-1A参与调节肌动蛋白重塑和维持细胞形态。在本研究中,我们对一个四代的中国Nance-Horan综合征家系的临床特征和分子遗传学机制进行分析,并在体外实验研究NHS基因的相关细胞学功能,为阐明该疾病的分子遗传学机制提供研究基础。研究方法1.家系内所有成员接受病史询问,眼部及全身系统性检查。使用Cyrlillic件绘制家系遗传图谱进行系谱分析。抽取家系成员全血提取基因组DNA。2.对该家系的一个男性患者进行全外显子组测序,结合此家系临床表型及遗传方式分析,选定x染色体上NHS基因上的一个无义突变c.322G>T(E108X)为可疑致病突变。通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)和Sanger测序,对该家系内其他成员进行NHS基因突变分析,同时对50名健康对照者的NHS基因的突变检测结果进行对比。另外,使用CLC Sequence Viewer5.5(CLC bio A/S, http://www.clcbio.com)软件对NHS蛋白序列在七个不同物种中进行多序列比对分析。3.构建表达NHS-1A蛋白的野生型质粒pEGFP-C2-NHS(NHS-EGFP)及突变质粒pEGFP-C2-NHS-c.322G> T (NHSE108X-EGFP).将NHS-EGFP, NHSE108X-EGFP, pEGFP-C2质粒瞬时转染进HEK293T细胞和SRA01/04细胞中。使用倒置荧光显微镜观察观察三种质粒在SRAO1/04细胞中的亚细胞定位。使用实时荧光定量PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction, QRT-PCR)分析转染三种质粒后HEK293T细胞中NHS mRNA的表达水平。化学合成针对NHS基因的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),将其转染进人晶体上皮细胞系SRAO1/04细胞中,通过Western blot分析Abi2蛋白的表达水平变化。通过Transwell小室迁移实验观察NHS表达受抑制后对SRA01/04细胞的迁移能力影响。研究结果1.该Nance-Horan综合征家系一共四代,其中七名家庭成员参加了本研究,包括3名男性患者,2名女性携带者及2名男性正常对照。所有男性患者自幼因“先天性白内障”接受双眼白内障手术,眼部其他表型包括双眼先天性小角膜,眼球震颤及斜视。除此之外,颅面部异常在三名患者中均有体现,一名男性患者有典型的牙齿异常。所有女性携带者均有不同程度的晶体混浊及双颞部缩窄。系谱分析该家系遗传方式可能为X连锁遗传。2.全外显子组测序结合Sanger测序发现NHS基因第一个外显子上的c.322G>T(E108X)突变为引起该家系临床病变的突变位点；多物种NHS蛋白内序列比对发现该突变位点第108位氨基酸残基位于高度保守区。3.倒置荧光显微镜显示野生型质粒定位于SRA01/04细胞的细胞质中,而突变型质粒定位于细胞核及细胞质中。QRT-PCR显示突变NHS基因的mRNA表达水平较野生型明显降低(p<0.05)。抑制SRA01/04细胞中NHS基因表达后,细胞内Abi2蛋白表达水平降低(P<0.05)；Transwell迁移实验显示siRNA组穿过小室细胞数较对照组明显降低(P<0.05)。结论：1.报道了国内首例Nance-Horan综合征家系。临床表型分析显示在家系中存在表型异质性。2.首次发现一个新的NHS基因无义突变c.322G>T(E108X).多物种NHS蛋白内序列比对发现该突变位点第108位氨基酸残基位于高度保守区。3.该突变导致NHS蛋白细胞学定位改变,并引发NHS基因mRNA降解。干扰NHS基因表达后,晶体细胞中Abi2蛋白表达水平下降,细胞迁移能力降低。