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雌激素相关受体α（estrogen related receptor α，ERRα）是最早被鉴定出来的孤儿核受体，虽然未被发现内源性配体，但它能通过募集辅调节因子，以组成性方式活化，调节基因转录，在细胞能量代谢和生理功能中发挥重要作用，从而参与一些常见疾病的病理过程，例如癌症、肥胖症、糖尿病等。ERRα还在成骨细胞分化的调节中发挥重要作用，因而成为治疗骨质疏松症的潜在靶点。然而，ERRα在骨代谢方面的现有研究结果尚存在不一致和未阐明之处。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是一种口腔临床中易于获得的间充质来源的成体干细胞。它具有多向分化潜能和自我更新能力。其成骨分化能力为牙周组织再生提供了新的手段。然而，PDLSCs成骨分化的调控机制尚未研究透彻。ERRα是否参与调控PDLSCs成骨分化尚不清楚。针对以上问题，本课题进行了如下研究：1. PDLSCs的培养鉴定及ERRα在PDLSCs中的表达目的：获取原代PDLSCs，检测ERRα在PDLSCs中的表达。方法：（1）取青少年因正畸治疗需要而拔除的前磨牙，刮取根中1/3牙周膜组织，用组织块结合酶消化法进行牙周膜原代细胞培养。采用有限稀释法进行克隆纯化并检测克隆形成率，CCK-8法检测细胞增殖；（2）流式细胞仪检测干细胞表面标志；（3）成骨、成脂诱导，并分别进行茜素红S和油红O染色检测PDLSCs分化能力；（4）RT-PCR检测PDLSCs中ERRα mRNA的表达；（5）免疫细胞化学和免疫荧光染色检测ERRα蛋白在细胞中的表达定位。结果：（1）原代培养并进行克隆纯化的PDLSCs呈成纤维细胞样形态，具有克隆形成能力和干细胞的增殖特点；（2）PDLSCs具有间充质干细胞的表面标志特征，并具有成骨和成脂分化能力；（3）PDLSCs表达ERRα mRNA和蛋白，其蛋白在细胞核和细胞质中均有广泛表达，主要高表达于细胞核。结论：成功培养并鉴定了具有间充质干细胞特征的PDLSCs，ERRα在该细胞中有广泛表达。2.慢病毒介导的ERRα基因沉默对PDLSCs成骨分化的调控作用目的：研究ERRα基因的下调对PDLSCs成骨分化的作用。方法：（1）设计针对ERRα基因的miRNA寡核苷酸序列四对，通过重组克隆的方法将其插入表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR，构建四个miRNA表达质粒，瞬时转染模型细胞，通过实时定量PCR和Western blot检测ERRα mRNA和蛋白的表达，验证干扰效率；（2）以筛选出的干扰效果最佳片段为模板构建慢病毒质粒pLenti-miR-ERRα，进行慢病毒包装和纯化，感染PDLSCs，构建稳转株，CCK-8检测细胞活性，并使用实时定量PCR和Western blot检测PDLSCs中ERRα mRNA和蛋白的表达；（3）病毒感染的PDLSCs成骨诱导分化后，通过ALP染色、茜素红S染色和实时定量PCR检测成骨相关基因ALP、OCN、RUNX2和OPN的mRNA表达，比较Lenti-miR-ERRα组与Lenti-miR-neg对照组PDLSCs成骨分化能力的差异。结果：（1）成功构建4个miRNA表达质粒，均能下调ERRα mRNA和蛋白的表达，其中pcDNA6.2-miR-ERRα-4干扰效果最佳，对其进行克隆重组、慢病毒包装和病毒液纯化；（2）成功构建Lenti-miR-ERRα稳转株，ERRα的mRNA和蛋白水平受到稳定的基因干扰，CCK-8结果显示Lenti-miR-ERRα组PDLSCs细胞活力与转染对照组和空白对照组相比略有降低；（3）Lenti-miR-ERRα组PDLSCs的ALP活性、矿化能力以及成骨相关基因ALP、OCN、RUNX2和OPN mRNA表达水平较转染对照组显著下降。结论：（1）慢病毒miRNA载体能稳定下调ERRα在PDLSCs中的表达；（2）ERRα的下调降低了PDLSCs成骨分化能力，提示ERRα可能对PDLSCs成骨分化有促进作用。3. ERRα在PGC-1α的辅助激活下对PDLSCs成骨分化的调控作用目的：研究ERRα在辅激活因子PGC-1α的激活下，对PDLSCs成骨分化的影响。方法：（1）ERRα反向激动剂XCT790作用于PDLSCs，成骨诱导后进行ALP活性检测、ALP和茜素红S染色。（2）构建ERRα和PGC-1α的表达载体，优化电穿孔转染PDLSCs条件，将两载体分别单独或共转染PDLSCs，实时定量PCR和Western blot验证转染效果；（3）将PDLSCs分组为：ERRα、PGC-1α、ERRα+PGC-1α组、空转染组和空转染+XCT790作用组；成骨培养7d后，测定细胞内Ca2+浓度，实时定量PCR检测成骨相关基因ALP、OCN、OPN、RUNX2和COL1A1的mRNA表达情况。结果：（1）XCT790显著降低PDLSCs ERRα和PGC-1α蛋白表达，并在成骨分化2周内强烈抑制ALP活性，最终降低矿化PDLSCs矿化能力；（2）成功构建ERRα和PGC-1α表达载体并分别单独或联合电穿孔转染PDLSCs，实时定量PCR和Western blot验证了mRNA和蛋白的过表达水平；（3）PDLSCs成骨诱导7d，ERRα过表达上调ALP、下调RUNX2和OPN的mRNA表达，PGC-1α过表达显著上调ALP、COL1A1和RUNX2而下调OPN mRNA的表达，ERRα+PGC-1α过表达显著上调ALP、COL1A1和RUNX2的mRNA表达，而对OCN、OPN的mRNA表达无显著影响；（4）XCT790不改变ERRα的mRNA表达水平，而通过下调ERRα蛋白和PGC-1α的mRNA与蛋白水平，显著降低ALP、COL1A1、OCN和RUNX2的mRNA表达，显著上调OPN mRNA表达和细胞内Ca2+浓度。结论：ERRα在PGC-1α的辅助激活下，能够通过提高ALP、COL1A1和RUNX2的表达水平而促进PDLSCs成骨分化。