构建基因工程骨髓源干细胞模拟GABA神经元分泌功能的实验研究

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癫痫(epilepsy),作为一种常见的中枢神经系统(central neuvous system,CNS)疾病,影响着大约0.5~1.0%的人口,因其异常复杂的发病机理及表型异质性,其临床治疗一直是个棘手问题,也一直是神经内外科和神经医学基础研究的难点。药物治疗一般作为首选,但仍有20~40%患者发作难以控制,成为难治性癫痫,值得注意的是,新型抗癫痫药物(antiepileptic drugs, AEDs)也没有明显减少癫痫耐药的百分比;手术治疗已经取得很大进展,但仍停留在切除和毁损阶段,不是所有的难治性癫痫都适合手术,且相当一部分患者疗效尚不令人满意;迷走神经刺激术和γ-刀治疗效果的确切性和安全性尚需进一步评估。因此,探索新的有效治疗途径,成为神经医学领域的关注热点之一。神经干细胞(neural stem cells, NSCs)移植和基因治疗(gene therapy)是癫痫治疗研究中的两个最新方向。NSCs具有自我更新、多向分化能力,可分化为各种神经胶质细胞和神经元谱系,具有明显的甚至远距离的病理上的趋向能力,沿轴突移行发展或在CNS局部分化,移植后可望修复动物疾病模型和人类疾病中该类受损的组织和细胞,有助于重建发育不良或受损的CNS分子和细胞环境,可考虑做为介导结构重建和基因转移的移植材料。基因治疗是应用分子生物学技术调节目的基因(与疾病发病及治疗相关基因)表达的一种新的治疗学方法,联合基因工程技术,将培养增殖的神经干细胞再植入哺乳动物脑内,可以适当整合入整个CNS并稳定表达外源基因,为包括癫痫在内的CNS疾病提供新的治疗手段。癫痫的发生与脑内兴奋性和抑制性神经递质的失衡相关。γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)是脑内最主要的抑制性神经递质,癫痫患者或癫痫模型动物脑组织中多存在GABA能神经元不同程度的数量减少和神经功能的不可逆性缺失,这提示如能向脑内补充能够分泌GABA的神经细胞就有可能抑制癫痫的发作。谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD)是GABA合成的限速酶,其催化谷氨酸(glutaminic acid, Glu)脱羧反应生成GABA,因而GAD对于调节脑部兴奋性和抑制性神经递质功能平衡起着重要作用。在GAD的两个亚型(GAD65和GAD67)中,GAD67的减少对GABA递质合成和释放的减少起主要作用,因此,联合基因工程技术、NSCs培养技术和立体定向技术,将转染GAD67基因的神经干细胞移植入脑内,增加GAD67的表达,可以促进GABA的合成,达到抑制癫痫发作的目的。本研究分五部分进行,重点探讨体外条件下,利用基因工程技术改造骨髓基质源性神经干细胞(Bone marrow stroma cells-derived neural stem cells,BMSCs-D-NSCs),探索构建基因工程化成体专能干细胞模拟GABA能神经元分泌功能的可行性,并初步建立方法学的体外技术平台。第一部分人类谷氨酸脱羧酶67基因的克隆及其两种真核表达载体的构建目的克隆获取人类谷氨酸脱羧酶GAD67基因,并构建pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD67两种重组真核表达载体。方法以人类胎脑组织cDNA为模板,应用GAD67基因特异性引物,用PCR方法扩增目的片段;将目的片段插入PUC57克隆载体,酶切、测序鉴定;再将GAD67的基因片段分别克隆至真核表达载体pEGFP-C2及pcDNA3.1,构建两种编码GAD67的重组真核表达载体,筛选克隆,经PCR、XhoⅠ及BamHⅠ双酶切及测序鉴定。结果成功扩增出人类GAD67基因ORF全长,大小为1785bp;目的基因GAD67成功克隆入PUC57载体,重组克隆载体命名为PUC57-GAD67;GAD67成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1及pEGFP-C2,筛选得到编码人类GAD67基因的两种重组质粒,命名为pcDNA3.1-GAD67及pEGFP-C2-GAD67。PCR鉴定,以pEGFP-C2-GAD67和pcDNA3.1-GAD67为模板,均可扩出约1800bp大小目的条带;双酶切pEGFP-C2-GAD67可切出约4.7kb和1800bp片段,双酶切pcDNA3.1-GAD67可切出约5.4kb和1800bp片段;测序结果显示,两重组真核表达载体上编码的GAD67序列均包含人类GAD67基因ORF全长,共1785bp,编码594个氨基酸残基,与NCBI提供的人类GAD67参考序列基本相符。结论应用基因重组技术,从胎脑组织cDNA中成功获取人类GAD67基因ORF全长,并成功构建pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD67两种重组真核表达载体,为进一步研究该基因功能及探索癫痫的基因治疗提供了前提条件。第二部分脂质体介导人类GAD67基因在哺乳动物细胞COS-7中的表达及检测目的分别从细胞、核酸和蛋白水平验证前期构建的编码外源性人类GAD67基因的pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD67真核表达载体在哺乳动物细胞中的表达情况。方法培养COS-7细胞并观察其生长情况;利用阳离子脂质体Lipfectamine 2000将编码人类GAD67基因的两种真核表达质粒分别转入哺乳动物细胞COS-7中;通过荧光显微镜直接观察或间接免疫荧光检测细胞内表达情况;利用RT-PCR方法检测细胞内GAD67 mRNA水平表达;利用SDS-PAGE和Westernblot验证GAD67蛋白表达情况。结果转染pEGFP-C2-GAD67后24h在荧光显微镜488nm激发光下观察,见大量细胞呈现绿色荧光,至72h可见绿色荧光细胞增多,荧光更加明亮;转染pcDNA3.1-GAD67后48h行免疫荧光检测,TRITC标记,在荧光显微镜520nm激发光下观察,见大量细胞发出红色荧光;两种转染细胞分别提取总RNA,RT-PCR产物电泳均可得到1800bp大小目的条带,证明均有GAD67 mRNA的表达;两种转染细胞分别提取总蛋白电泳后,在约67 KD位置均可见一明显蛋白条带,Western-blot均显示出目的印迹,在蛋白水平证实,GAD67基因能够在COS-7细胞中正确表达出GAD67蛋白。结论本实验利用脂质体转染法将前期构建的编码外源性GAD67的两种真核表达载体成功导入COS-7细胞,并分别从细胞、核酸、蛋白等多个水平证实在哺乳动物细胞系中能够实现有效表达,为下一步转染原代培养的BMSCs-D-NSCs奠定了重要基础,并提供了参考条件。第三部分人类GAD67基因转染骨髓基质源性神经干细胞并检测其表达情况目的利用转基因技术将GAD67基因转入BMSCs-D-NSCs,获得GAD67基因改造的成体专能干细胞,使之能够分泌表达GAD67蛋白。方法利用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓基质细胞(rat Bone marrow stroma cells, rBMSCs),用专用NSCs培养基(专利号ZL.02134314.4)促其向NSCs方向分化,得到BMSCs-D-NSCs,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,免疫细胞化学检测细胞内巢蛋白(Nestin)表达;再利用阳离子脂质体Lipfectamine 2000将编码人类GAD67基因的真核表达质粒pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD67分别转染入BMSCs-D-NSCs,荧光显微镜下直接观察或间接免疫荧光法检测转染情况;利用流式细胞仪分析检测转染效率;应用RT-PCR方法检测转染细胞内GAD67 mRNA水平表达;应用SDS-PAGE和Western blot检测并鉴定GAD67蛋白。结果体外原代培养的BMSCs贴壁生长,72h后细胞呈梭形、三角形或圆形,培养5d检测有大量Nestin阳性细胞;多次传代后,长满的细胞可呈规则成排或漩涡状排列;培养3w后细胞分化,可有长突起生长并相互连接成网状。在荧光显微镜488nm激发光下直接观察转染pEGFP-C2-GAD67后BMSCs-D-NSCs内绿色荧光蛋白表达情况,可见大量细胞发出绿色荧光,至72h可见绿色荧光细胞增多,荧光更加明亮;间接免疫荧光检测(FITC标记)转染pcDNA3.1-GAD67后BMSCs-D-NSCs内GAD67蛋白表达情况,在488nm激发光下观察,可见大量细胞发出FITC标记的绿色荧光;两种载体转染效率分别为39.3%和40.5%;RT-PCR检测两种质粒转染后的BMSCs-D-NSCs均可得到约1800bp目的条带,证实有GAD67 mRNA水平表达;SDS-PAGE检测转染细胞及培养基上清中蛋白均可见约67KD处有明显条带,培养基上清中比细胞中提取的目的蛋白浓度更高,Western blot证实该条带为GAD67蛋白。结论本实验证实:1.原代培养BMSCs,利用专用NSCs培养基,经体外培养扩增,可以促其向NSCs方向分化;2.脂质体Lipofectamine 2000介导编码GAD67的两种真核表达载体均能有效转染BMSCs-D-NSCs;3.GAD67基因改造的BMSCs-D-NSCs可以有效表达GAD67蛋白,且分泌到细胞外培养基上清中的目的蛋白浓度比细胞内更高;4.EGFP基因序列在GAD67基因序列前,共用同一启动子,同框表达,没有影响GAD67的转录、翻译、修饰,包括信号肽剪切等过程,没有影响GAD67蛋白的分泌表达。第四部分纳米载体介导GAD67基因转染骨髓源性神经干细胞的初步研究目的本实验试用纳米材料作为基因转移载体,对其DNA负载效率和对BMSCs-D-NSCs的转染能力做初步的研究;并从细胞、核酸和蛋白等多个水平检测在该纳米载体介导条件下GAD67基因在BMSCs-D-NSCs内的表达情况。方法利用丁二酸酐(Succinic Anhydride)与端基为羟基的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)反应,生成端基为羧基的PEG(PEG-COOH),用N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxyl succimide,NHS)活化端羧基PEG(PEG-COOH)后与聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)反应,得到PEG与PEI的接枝共聚物bPEI-g-1PEG,利用1H NMR分析表征,利用梯度混合琼脂糖凝胶电泳(AGE)检测PEI-g-PEG对DNA负载效率;利用密度梯度离心法分离培养大鼠原代BMSCs,用专用NSCs培养基促其向NSCs方向分化,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,免疫细胞化学检测细胞内巢蛋白(Nestin)表达;利用PEI-g-PEG共聚物介导pEGFP-C2-GAD67真核表达载体转染BMSCs-D-NSCs,荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白表达情况;RT-PCR鉴定GAD67 mRNA的表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定GAD67蛋白。结果1H NMR分析表明,接枝反应发生后,在2.5~3.0 ppm处出现PEI的振动峰,说明PEG成功接枝到PEI链段上。bPEI-g-lPEG共聚物对pEGFP-C2-GAD67质粒DNA最适负载比例为5~10:1。bPEI-g-lPEG纳米载体介导pEGFP-C2-GAD67转染BMSCs-D-NSCs 24h后即可见大量细胞发出绿色荧光,至72h可见绿色荧光细胞增多,荧光更加明亮。转染效率约25%~35%,推荐转染剂量为PEI-g-PEG用量20~40μg/孔,DNA0.8~1.6μg/孔(24孔板)。转染48h后提取总RNA,RT-PCR产物电泳可得到1800bp大小目的条带,证实有GAD67 mRNA的表达。提取总蛋白及留取培养基上清,SDS-PAGE均可发现67KD处有较浓蛋白条带,Western blot证实为GAD67蛋白。结论本实验合成PEI-g-PEG共聚物作为基因转移载体,负载pEGFP-C2-GAD67,成功转染BMSCs-D-NSCs,并能够正常分泌表达GAD67蛋白。第五部分RP-HPLC-荧光法检测GAD67基因工程干细胞培养基中GABA的含量目的测定基因工程干细胞培养基中GABA含量,间接了解转染GAD67基因的BMSCs-D-NSCs中表达的外源性GAD67蛋白的功能活性。方法RP-HPLC-荧光法。色谱条件:岛津C18反相色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);衍生化试剂为邻苯二甲醛(OPA);流动相为甲醇-0.02mol·L-1K2HPO4(45:55),pH 6.8;检测波长:激发光波长λEx为335nm,发射光波长λEm为445nm;流速1.0ml/min。外标法定量。利用C-R1B数据处理仪自动记录数据,利用Excel2003及SPSS13.0统计软件进行数据转换和数据汇总。结果方法学确证:GABA在测定范围内(0.1~20μmol·L-1)峰面积(A)与浓度(C)线性关系良好,回归方程为Y=1577.06X+448.95,相关系数(r)为0.9989;方法回收率大于90%;精密度:日内差小于7%,日间差小于11%;最低检测浓度为0.1μmol·L-1。色谱行为:GABA的保留时间为10.6 min,峰形态良好,与其他杂峰分离清楚。检测计算转基因干细胞培养基原液中GABA浓度约为31.50μmol·L-1,而对照培养基中未检测到有大量GABA生成(低于0.1μmol·L-1)。正常人或动物脑脊液中GABA含量大约在100~260nmol·L-1之间,与之相比,基因工程干细胞培养基中可得到高达100~300倍含量的GABA。结论转基因BMSCs-D-NSCs分泌表达的GAD67蛋白具有良好的功能活性,做为限速酶可以催化生成大量GABA;转基因干细胞培养基中的高浓度GABA为其表达的外源性GAD67蛋白催化而成,并非为细胞自身产生。小结BMSCs是NSCs的主要来源之一,也是细胞移植治疗CNS疾病的重要的种子细胞,但目前尚难以将BMSCs高效诱导分化为特定的分泌单相递质的功能神经元,包括GABA能神经元。基因工程技术可以作为调节细胞内递质分泌的有效手段,使移植的干细胞更专一、有效地发挥特定功能。本实验研究表明:1.利用分子克隆技术,从人类胎脑组织可以成功获取GAD67 ORF全长;构建的pEGFP-C2-GAD67及pcDNA3.1-GAD67两种真核表达载体,均可有效启动GAD67的基因表达;2.作为基因转移载体,脂质体lipofectamine 2000和纳米材料bPEI-g-lPEG都可以有效介导GAD67基因转染BMSCs-D-NSCs;3.转染GAD67的基因工程干细胞能够分泌表达目的蛋白,且表达的外源性GAD67蛋白具有良好的酶活性,可以催化生成高浓度的GABA;4.作为一种荧光标签,pEGFP-C2-GAD67载体上的EGFP序列编码在GAD67序列前,与之共用同一启动子,同框表达,没有影响GAD67的转录、翻译、信号肽剪切等过程,没有影响GAD67蛋白的分泌表达及功能活性。本实验表明,GAD67改造的基因工程BMSCs-D-NSCs可以模拟GABA能神经元发挥GABA递质分泌功能,并初步建立了分泌GABA的基因工程干细胞体外技术平台,为未来细胞移植和基因治疗癫痫奠定了实验基础。
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