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背景和目的: 多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是继非霍奇金淋巴瘤之后的第二种常见血液系统恶性疾病，在恶性血液疾病中占13%。目前尚无法治愈。硼替佐米（bortezomib，BTZ）是第一代蛋白酶体抑制剂，其对多发性骨髓瘤的疗效显著，以PD为主的方案为国内外指南推荐的一线治疗方案，且硼替佐米（万珂）于2017年9月进入我国国家医保目录，使得更多的多发性骨髓瘤中国中国患者可以用上此药。不过，为了进一步提高疗效，在PD方案基础上加用辅助药物依然是血液科医师治疗MM时面临的挑战。 重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡配体（recombinant mutant of human TRAIL，rmhTRAIL）是一种重组蛋白类抗肿瘤药物，由我国北京沙东生物公司研制并且正在进行rmhTRAIL为主的方案治疗难治复发多发性骨髓瘤的临床试验。rmhTRAIL联合硼替佐米可能成为更适合中国多发性骨髓瘤患者的方案。 表观遗传学引入对疾病的分层、治疗和用药等有重大的指导作用。微小RNA可以在转录的调节，蛋白的表达等诸多方面影响生命活动。miR-17-5p和miR-886-5p为调节肿瘤表达两种重要微小RNA，在乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤中，已经被广泛研究，单尚无其和多发性骨髓瘤的相关报道。由上背景，本课题旨在探索以下问题。 1. 探索rmhTRAIL单药对多发性骨髓瘤细胞株增殖抑制的影响。 2. 测量rmhTRAIL药物处理后多发性骨髓瘤中miR-17-5p和miR-886-5p的变化。 3. 探索BTZ单药及rmhTRAIL联合BTZ对多发性骨髓瘤细胞株增殖抑制的影响。 4. 测量BTZ单药及rmhTRAIL联合BTZ处理后多发性骨髓瘤中miR-17-5p和miR-886-5p的变化。 方法 1. 培养人多发性骨髓瘤细胞株U266B1和NCI-H929。使用CCK-8法测量rmhTRAIL（0/78.125/312.5/1250/5000/20000ng/ml）对其增殖抑制的影响，并采用流式细胞术的方法测量细胞凋亡，MM细胞分别使用药物处理后，提取其中的miR-886-5p和miR-17-5p，比较含量的差异，通过统计学分析是否和药物作用呈现相关性。 2. 培养人多发性骨髓瘤细胞株U266B1和NCI-H929。使用CCK-8法测量rmhTRAIL（20000ng/ml）联合不同浓度的BTZ（10/20/40/80/160nM）对其增殖抑制的影响，并采用流式细胞术测量细胞凋亡率。MM细胞分别使用药物处理后，提取其中的miR-886-5p和miR-17-5p，利用PCR的方法比较含量的差异，通过统计学分析是否和药物作用呈现相关性。 结果 1 CCK-8法检测rmhTRAIL对多发性骨髓瘤细胞增殖抑制的影响 rmhTRAIL对多发性骨髓瘤NCI-H929细胞株具有增殖抑制性。不同剂量rmhTRAIL（0/78.125/312.5/1250/5000/20000ng/ml）RMHTRAIL作用于NCI-H929细胞，24h增殖抑制率的变化趋势为，（-1.34±0.45）%增加到（35.66±0.39）%，48h增殖抑制率从（6.53±0.33）%增加到（52.23±0.96）%，72h增殖抑制率从（19.73±0.84）%增加到（70.04±0.56）%，呈时间依赖性和浓度依赖性（P<0.05）。RMHTRAIL处理多发性骨髓瘤细胞24h、48h、72h后的IC50值分别为（63579.532±4.803)ng/ml，(15580.413±4.193)ng/ml，(5181.069±3.714)ng/ml。 与NCI-H929细胞形成鲜明对比的是，不同剂量的rmhTRAIL （0/78.125/312.5/1250/5000/20000ng/ml）rmhTRAIL作用于U266B1细胞，24h增殖抑制率的变化趋势为，（-5.62±0.24）%增加到（4.66±0.14）%，48h增殖抑制率从（2.23±0.32）%增加到（7.84±0.36）%，72h增殖抑制率从（1.73±0.32）%增加到（9.04±1.26）%，不呈现时间依赖性和浓度依赖性（P>0.05）。 2 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测rmhTRAIL处理多发性骨髓瘤后的细胞凋亡率 取rmhTRAIL的IC50浓度作用于作用U266B1和NCI-H929细胞48h后，U266B1细胞凋亡率从（6.61±0.67）%增加到（7.06±0.28）%，而NCI-H929细胞的凋亡率从（5.59±0.03）%增加到（27.13±1.35）%。使用SPSS软件进行统计学处理，发现rmhTRAIL对NCI-H929的增殖抑制有统计学意义（p＜0.05），而对于U266B1细胞则无统计学意义（p>0.05）。 3 rmhTRAIL对MM细胞中miR-17-5p和miR-886-5p的影响 rmhTRAIL处理U266B1细胞后，使用Trizol试剂提取其中的microRNAs并行反转录，PCR，测量miR-17-5p和miR-886-5p在细胞中的含量变化无统计学意义。rmhTRAIL处理NCI-H929细胞后，miR-17-5p和miR-886-5p含量变化有统计学意义，两者的含量均明显降低。 4 CCK-8法检测BTZ及rmhTRAIL联合BTZ对多发性骨髓瘤细胞增殖抑制的影响 rmhTRAIL对多发性骨髓瘤NCI-H929细胞株具有增殖抑制性。不同剂量BTZ（10/20/40/80/160nM）作用于NCI-H929细胞，24h增殖抑制率的变化趋势为，（6.79±0.79）%增加到（42.02±0.56）%，48h增殖抑制率从（12.14±0.85）%增加到（69.99±0.73）%，72h增殖抑制率从（14.10±0.51）%增加到（81.70±1.28）%，呈时间依赖性和浓度依赖性（P<0.05）。BTZ处理多发性骨髓瘤细胞24h、48h、72h后的IC50值分别为（211.95±1.87)ng/ml，(73.78±1.87)ng/ml，(56.22±1.75)ng/ml。 不同剂量BTZ（10/20/40/80/160nM）作用于U266B1细胞，24h增殖抑制率的变化趋势为，（6.29±0.31）%增加到（9.25±0.59）%，48h增殖抑制率从（7.54±0.21）%增加到（56.97±0.85）%，72h增殖抑制率从（12.71±0.22）%增加到（70.23±0.76）%，不呈现时间依赖性和浓度依赖性（P＜0.05）。BTZ处理多发性骨髓瘤细胞U266B1种系24h、48h、72h后的IC50值分别为（216.13±2.33)ng/ml，(121.68±2.09)ng/ml，(72.03±1.86)ng/ml。 rmhTRAIL联合BTZ得到了和BTZ单药相似的结果。不同剂量BTZ （10/20/40/80/160nM）作用于U266B1细胞，24h增殖抑制率的变化趋势为，（2.61±0.90）%增加到（54.26±0.72）%，48h增殖抑制率从（8.73±0.65）%增加到（53.95±1.46）%，72h增殖抑制率从（11.63±0.85）%增加到（72.88±1.24）%，呈时间依赖性和浓度依赖性（P<0.05）。 rmhTRAIL联合不同剂量BTZ（10/20/40/80/160nM）作用于NCI-H929细胞，24h增殖抑制率的变化趋势为，（55.91±0.48）%增加到（92.56±0.54）%，48h增殖抑制率从（60.25±1.30）%增加到（92.58±1.52）%，72h增殖抑制率从（72.52±0.81）%增加到（93.23±1.09）%，不呈现时间依赖性和浓度依赖性（P＜0.05）。 5 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测rmhTRAIL处理多发性骨髓瘤后的细胞凋亡率 取BTZ的IC50浓度作用于作用U266B1和NCI-H929细胞48h后，U266B1细胞凋亡率从（5.89±0.18）%增加到（26.43±0.86）%，双药联合的增殖抑制率为（26.95±1.87）。而NCI-H929细胞的凋亡率从8.78±0.99）%增加到（24.32 ±0.53）%，双药联合的增殖抑制率达到（30.35±1.35）。使用SPSS软件进行统计学处理，发现BTZ组及RMHTRAIL联合BTZ组对NCI-H929和NCI-H929细胞的增殖抑制有统计学意义（p＜0.05）。 6 BTZ及rmhTRAIL联合BTZ对MM细胞中miR-17-5p和miR-886-5p的影响 BTZ单药及RMHTRAIL联合BTZ处理U266B1细胞后，miR-17-5p和miR-886-5p在细胞中的含量变化无统计学意义。BTZ单药及RMHTRAIL联合BTZ处理NCI-H929细胞后，miR-17-5p和miR-886-5p含量变化有统计学意义，两者的含量均明显降低。 小结 1. rmhTRAIL对多发性骨髓瘤细胞株NCI-H929具有增长抑制，对于多发性骨髓瘤细胞U266B1无增殖抑制作用。 2. rmhTRAIL处理NCI-H929细胞，其中miR-17-5p和miR-886-5p的减少有统计学意义，而对于U266B1细胞则无统计学意义。 3. BTZ对MM细胞U266B1和NCI-H929均有较明显的抑制作用。BTZ联合rmhTRAIL对NCI-H929具有显著的抑制作用，且双药表现出协同作用，对于U266B1细胞同样具有增殖抑制作用，但是两药无协同作用。 4. rmhTRAIL联合BTZ处理多发性骨髓瘤细胞NCI-H929和U266B1，其中miR-17-5p和miR-886-5p的减少有统计学意义。