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本文从3-4日龄的SD大鼠颅盖骨中分离获得成骨细胞(osteoblast, OB),采用第2-3代的OB研究1α,25-(OH)2D3对OB增殖分化、细胞周期、[Ca2+]i以及超微形态结构的影响,为研究1α,25-(OH)2D3对骨代谢性疾病的防治提供理论依据。1成骨细胞的培养与鉴定为研究各种因子对骨代谢性疾病影响的部分机制,选取3-4日龄SD大鼠颅盖骨,采用胰酶、胶原酶两步消化法获得OB,80%融合后传代。倒置显微镜下观察OB的形态及生长情况,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和茜素红矿化结节染色特异性鉴定OB,MTT法测定OB的生长周期。结果,本方法分离的OB生长状态良好,纯度较高,能满足一般试验的需要。2 1α,25-(OH)2D3对体外培养成骨细胞增殖分化的影响为研究1α,25-(OH)2D3对体外培养OB增殖分化的影响,在体外分离SD大鼠乳鼠颅盖骨获得OB培养基础上,细胞传代培养,待80%融合后,添加不同浓度1α, 25-(OH)2D3作用1、3、5d,通过MTT法观察细胞增殖,对硝基苯磷酸二钠(p-nitrophenyl phosphate,PNPP)法检测细胞培养液中ALP活性。结果,1、3、5 d时,添加1α,25-(OH)2D3各组OB增殖均受抑制,10-8、10-7 mol/L组差异极显著(P<0.01)。1 d时不同浓度1α,25-(OH)2D3组ALP活性均极显著高于对照组(P<0.01);3、5 d时,10-7 mol/L组ALP活性明显降低,与对照组差异极显著(P<0.01),其余各组间差异不显著(P>0.05)。说明1α,25-(OH)2D3对OB增殖具有抑制作用,低浓度抑制OB分化,高浓度促进OB分化。3 1α,25-(OH)2D3对体外培养成骨细胞周期及[Ca2+]i的影响在体外培养SD大鼠乳鼠颅盖骨OB基础上,添加不同浓度的1α,25-(OH)2D3(0、10-9、10-8、10-7 mol/L),作用20 min、24 h,分别测定[Ca2+]i,48 h后,碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色,流式细胞仪分析细胞周期。结果,20min时,不同浓度1α,25(OH)2D3组[Ca2+]i均显著高于对照组(P<0.05),24 h时10-9 mol/L 1α, 25-(OH)2D3组[Ca2+]i则显著低于对照组(P<0.05),其余各组间差异不显著(P>0.05);作用48 h后,10-9、10-8、10-7mol/L1α,25-(OH)2D3组OB滞留在G2/M期,表明1α,25-(OH)2D3抑制OB增殖。4 1α,25-(OH)2D3对体外培养成骨细胞超微形态结构的影响在体外培养SD大鼠乳鼠颅盖骨OB基础上,添加不同浓度的1α,25-(OH)2D3,作用48 h后,透射电镜、扫描电镜观察各组OB的超微形态结构。结果表明,与对照组相比,10-9 mol/L 1α,25-(OH)2D3组细胞铺展较好,表面突起、线粒体数量增多;10-8 mol/L 1α,25-(OH)2D3组细胞趋于扁平,表面突起减少且呈现细长状,内质网数量增多,线粒体减少;10-7 mol/L 1α,25-(OH)2D3组细胞外基质中大量丝状纤维连接成网状,胞内细胞器较少,出现大量空泡,胞浆内含有大量钙颗粒沉积。说明,随着1α,25-(OH)2D3浓度的增加,细胞趋于扁平,更利于与骨表面接触,从细胞超微形态结构来说明高浓度1α,25-(OH)2D3能够抑制OB增殖,促进OB的分化及功能表达。