论文部分内容阅读
单克隆抗体药物是由动物细胞表达的具有生物活性的大分子蛋白药物,随着近些年单克隆药物的开发和发展,对抗体生产工艺的研究逐步深入,对生产工艺批件差异的要求也越来越严格。工艺表征研究是“质量源于设计”(Quality by design,QbD)的重要环节。QbD的理念主要是通过风险评估的方式,确定关键质量属性(Critical quality attribute,CQA),通过工艺表征研究确定影响CQA的关键工艺参数(Critical process parameter,CPP)与影响主要工艺属性(Key process attribute,KPA)的主要工艺参数(Key process parameter,KPP),然后对CPP/KPP的范围进行系统性的研究,最终确定参数的设计空间(Design space)、工艺的控制策略(control strategy)等。根据工艺开发的进程,通常在III期临床研究之前,需要对生产工艺进行表征研究。进行工艺表征研究的目的是提高工艺稳定性,减少批次间差异,减少生产中的偏差,降低失败的风险,最终保证产品质量的均一性。本文所研究的对象即为我国正在进行临床Ⅲ期的单克隆抗体项目的细胞培养工艺,目的是为商业生产阶段生产工艺范围设定提供指导,更好地稳定细胞培养工艺,减少工艺失败风险。该细胞培养工艺是在500L反应器上进行的,得到的蛋白依次进入到纯化和制剂后其产品将被应用到经放疗和化疗后肿瘤仍有进展的疾病治疗中,具有巨大的实际应用价值。因此,本文进行的细胞培养工艺表征研究的目的是:评估上游细胞培养工艺中影响抗体CQAs的CPPs和影响KPAs的KPPs;最终建立了缩小模型为后续的工艺研究提供实验基础。同时得到了各个关键工艺参数对关键工艺属性的影响关系。首先通过风险评估方法确认了关键质量属性为抗体的多聚体,电荷异质体中的主峰成分、抗体片段和抗体糖型,然后通过对各个工艺步骤对关键质量属性产生直接影响的工艺步骤进行评估,最终确认了关键工艺属性为最终收获时的活细胞密度>15×10~6cells/ml,收获时细胞活率>80%,以及收获时蛋白抗体浓度>2.0g/L。根据这些指标然后确定了从细胞复苏到生产罐结束时各个步骤中,哪些是关键工艺步骤。最终确定关键工艺步骤为:50L反应器种子扩增反应器和500L生产反应器。再对这两个工艺步骤中的参数进行分析,确定了关键工艺步骤中的关键工艺参数,即需要研究的工艺参数为:生产罐上的培养pH值、生产罐上培养温度降低时的活细胞密度、生产罐上降温的时间、生产罐上降温的温度、生产罐上初始的接种密度、生产罐上的溶氧值、生产罐上的培养时间,以上这些参数细胞进行仔细确切的实验研究;另外种子罐上需要进行研究的参数包括:转种是的种子密度、种子罐扩增前的种子密度、种子的种龄、种子罐种子细胞稀释的活细胞密度。为了能在小规模反应器上进行能够代表500L反应器的实验研究,所以我们首先开始了缩小模型的建立,分别在2L罐和5L罐上进行缩小模型的建立,建立的方法为:1、功率相等法缩小;2、搅拌桨叶尖线速度相等法缩小;3、一般技术(平台技术)法缩小。在得到实验结果后首先通过直接目视法判定了缩小模型的有效性,发现第一轮实验时细胞生长、细胞代谢和蛋白产量都能够与500L数据吻合,但在葡萄糖浓度上与500L反应器上有较大的差异,在收获时葡萄糖浓度差异最大达到4.0g/L,通过原因分析后对补料培养基的流加策略进行了优化,再进行了确认实验。调整了补料策略后得到的缩小模型通过直接目视比较法和单侧T检验法验证后,确认了收获时细胞密度约为23×10~6cells/ml,活率约为90%,表达量约为4.5g/L,符合关键工艺属性的要求,确认了2L和5L缩小模型具有等效性。在通过了2L罐和5L罐缩小模型的等效性验证后,在2L罐上进行了生产罐上关键工艺参数的研究,分别研究了如下参数对应范围内对关键质量属性(CQAs)和主要工艺属性(KPAs)的影响:初始活细胞密度(Initial VCD)在0.4×10~6cells/ml-1.0×10~6cells/ml范围内;初始培养温度(Initial Temperature)在35.5℃-37.5℃范围内;培养温度降温时间(Shift temperature time)在第7天-第9天范围内;培养温度降温水平(Shift temperature level)在33.5℃-35.5℃范围内;培养pH值在6.8-7.2范围内;培养的时间在第13天-第15天范围内;研究结果如下:1、在2L罐缩小模型上对生产罐上初始温度、初始活细胞密度、降温活细胞密度、降温时间、降温时间、培养周期等参数在表征范围内都不会对关键质量属性和主要工艺属性造成超限的风险。2、在对培养pH在6.8-7.2范围进行研究后发现pH在6.8-7.2范围不会对关键质量属性产生超限影响,但pH在6.8时造成了蛋白表达量超限,所以根据这一结果将pH的控制范围调整为6.9-7.2。在5L罐上对50L种子扩增罐上的相关参数进行了研究,主要包括:种子细胞代次对500L罐种子多一代和少一代;种子罐接种前的种子活细胞密度在2.0×10~6cells/ml和5.0×10~6cells/ml;种子罐上细胞稀释时的密度分别为2.0×10~6cells/ml和5.0×10~6cells/ml;种子罐接种到生产罐前的活细胞密度分别为2.0×10~6cells/ml和5.0×10~6cells/ml;研究结果如下:3、种子传代和扩增处理方式在表征范围内,虽然对生产罐上的CQAs和KPAs有潜在的影响,但并未有超限的风险。通过对研究结果的总结分析,我们得到了各个已研究参数与关键质量属性(CQAs)和关键工艺属性(KPPs)间的关系,以及工艺参数对关键质量属性和工艺属性间的影响关系。对于指导500L反应器连续生产过程中保障生产的连续性和稳定性具有重大的意义。