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水貂阿留申病(Aleutian Mink Disease,AD)又称水貂浆细胞增多症(Plasmacytosis)是由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease Virus,AMDV)感染引起水貂自身免疫系统功能紊乱的慢性、传染性疾病。该病的典型特征为渐进性消瘦、繁殖力下降、血清γ球蛋白增多、脾脏肿大、肾脏改变(从肿胀和瘀点到萎缩和凹陷)和肠系膜淋巴结肿大。AMDV可通过水平和垂直方式传播,引起母貂自然流产和仔貂死亡,能明显影响水貂繁殖性能和毛皮质量,AD是影响水貂养殖业的三大疫病之一。目前仍没有可用于预防的疫苗,也无可以彻底根治的治疗方案,只有通过定期的检疫、淘汰,达到逐步净化貂群的目的。因此,探索建立灵敏、高效、准确的诊断方法,开展流行病学调查以及针对AMDV开展分子生物学研究是非常必要的。本研究根据AMDV的VP2基因的保守区域设计一对特异性引物和探针,建立荧光定量PCR检测方法,标准曲线在1.0×102拷贝/μL至1.0×108拷贝/μL之间具有良好的线性关系,相关系数(r2)大于0.994,该方法检测的灵敏度为102拷贝/μL,且与犬细小病毒、犬腺病毒、犬瘟热病毒和水貂病毒性肠炎病毒均无明显交叉反应,特异性良好。组内和组间变异系数均小于5%,重复性良好。利用该方法对417份临床组织病料样品检测结果显示,我国部分地区的阳性率为81.5%。为了进一步研究AMDV的基因组特征,本研究从上述阳性样本中挑选部分进行全基因组扩增并测序,测序结果与GenBank中的参考序列进行比对,构建进化树并进行同源性分析。结果显示,14株测序株间的核苷酸相似性为93.1%-99.6%,与GenBank中的AMDV参考序列的相似性为92.0%-97.1%。进化树将所有毒株划分为六支,我国AMDV毒株显示出较明显的同源性,表明进入中国的AMDV交叉传播进化,形成复杂的遗传特征。对非结构蛋白NS1、NS2、NS3和结构蛋白VP1、VP2的氨基酸序列进行比对分析,发现一些特殊位点的氨基酸突变,显示出AMDV具有高度的遗传多样性。为了有效防控AD对水貂养殖业的危害,疫苗开发为首要选择。但是,目前报道仅有一株分离毒株AMDV-G可以在克兰德尔猫肾细胞(Crandell feline kidney cells,CRFK)增殖,野毒株均无法传代。为实现进一步探索,本研究根据GenBank中的ADV-G的全序列,参考上述序列测定结果,人工合成基因组克隆质粒pUC-AMDV-G和pUC-AMDV-Gluc。分别替换pBluescript SKⅡ(+)载体,构建质粒pBlue-AMDV-G和pBlue-AMDV-Gluc。pBlue-AMDV-G中再引入增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因,命名为pBlue-AMDV-EGFP,共构建三种感染性克隆。三种质粒分别转染CRFK细胞,进行盲传。对荧光素酶和绿色荧光蛋白的检测结果显示两种加入标签基因的质粒拯救病毒失败。p Blue-AMDV-G质粒转染产物经盲传三代后可检测到特异性转录模式,但转录水平较低,证明病毒虽拯救成功但数量较少。感染性克隆的构建仍需完善。总之,本研究建立了一种重复性、特异性和敏感性良好的AMDV荧光定量PCR检测方法,可用于AMDV的临床检测和流行病学调查。测定分析了部分毒株的全基因组序列,为我国AMDV的基因功能及遗传特征提供理论依据。尝试构建了AMDV感染性克隆,为进一步研究AMDV的生物学特征和致病机理奠定基础,为研制AMDV疫苗提供探索方向。