第一章羟氯喹增强酪氨酸激酶抑制剂对T315I突变细胞的杀伤作用背景:T315I是最常见的BCR-ABL激酶区点突变,该突变造成BCR-ABL融合蛋白第315位苏氨酸被异亮氨酸取代,引起融合蛋白的构象和功能发生变化,是造成CML多药耐药的重要原因。带有BCR-ABLT3151突变的CML对伊马替尼、达沙替尼、尼罗替尼和博舒替尼等多种TKIs耐药,第三代TKIs-博纳替尼是目前治疗T315I突变CML的一线药物,另外有文献报道血管表皮生长因子受体抑制剂—阿西替尼也可以在体外杀伤T315I突变的CML细胞。在药物压力下肿瘤细胞可以通过"自噬"来维持细胞内稳态避免细胞凋亡,因此"自噬"是肿瘤细胞对抗药物杀伤的利器。伊马替尼通过抑制BCR-ABL的激酶活性在杀伤CML细胞的同时也诱导了 CML细胞自噬,自噬在一定程度上削弱了伊马替尼的杀伤作用。在伊马替尼治疗的同时,利用自噬抑制剂羟氯喹(HCQ)抑制CML细胞自噬可以显著增强伊马替尼的抗肿瘤作用。在T315I突变CML细胞中,阿西替尼、博纳替尼能否诱导细胞自噬,自噬是否为T315I突变CML细胞逃避药物杀伤的一种机制,自噬抑制剂羟氯喹(HCQ)能否增强阿西替尼、博纳替尼对T315I突变CML细胞的杀伤作用目前尚无报道。目的:研究自噬抑制剂—羟氯喹(HCQ)是否能够增强阿西替尼、博纳替尼对32Dp210-T315I细胞的杀伤,并进一步揭示HCQ的作用机制,为T315I突变CML的治疗提供思路和方向,为推动HCQ联合TKIs在耐药CML治疗中的应用奠定基础。方法:以稳定表达BCR-ABLT3151的32D细胞(32Dp210-T315I细胞)为主要研究对象,利用Western Blot检测LC3Ⅱ的表达、利用共聚焦免疫荧光显微镜观察自噬小体,分析阿西替尼、博纳替尼是否能够诱导细胞自噬。检测HCQ能否抑制阿西替尼、博纳替尼诱导的细胞自噬,并比较阿西替尼、博纳替尼联合/不联合HCQ处理后32Dp210-T315I细胞的凋亡(流式检测Annexin V/7AAD)、克隆形成(在半固态的甲基纤维素培养液中进行7天的克隆形成实验)、周期(细胞固定/破膜后经PI染色,并采用流式细胞仪检测)及细胞衰老(衰老相关β-半乳糖苷酶染色),分析HCQ是否能够增强阿西替尼、博纳替尼对32Dp210-T315I细胞的杀伤作用。为了进一步验证HCQ是否通过抑制自噬发挥作用,利用shRNA敲降自噬蛋白ATG7来抑制细胞自噬,阿西替尼、博纳替尼处理ATG7敲降和未敲降的32Dp210-T315I细胞后比较细胞的凋亡和周期,分析抑制自噬是否增强了阿西替尼、博纳替尼在T315I突变CML治疗中的作用。采用32Dp210-T315I细胞建立裸鼠皮下成瘤的模型,比较阿西替尼单药治疗和HCQ联合阿西替尼治疗对小鼠肿瘤的抑制作用。结果:阿西替尼、博纳替尼诱导32Dp210-T315I细胞自噬。HCQ抑制了阿西替尼、博纳替尼诱导的细胞自噬,并且增强了阿西替尼、博纳替尼诱导的32Dp210-T315I细胞凋亡,增强阿西替尼、博纳替尼对细胞克隆形成的抑制作用;但并不能增强阿西替尼、博纳替尼诱导的32Dp210-T315I细胞周期阻滞和细胞衰老。靶向ATG7的shRNA可以有效敲降ATG7蛋白的表达,并抑制了阿西替尼、博纳替尼诱导的32Dp210-T315I细胞自噬。与HCQ的作用相似,ATG7蛋白敲降增强了阿西替尼、博纳替尼诱导的细胞凋亡,对阿西替尼、博纳替尼诱导的细胞周期阻滞无影响。结论:HCQ通过抑制自噬增强了阿西替尼、博纳替尼对32Dp210-T315I细胞的杀伤作用。第二章羟氯喹促进NKG2D-ULBP4介导的Vy9Vδ2 T杀伤酪氨酸激酶抑制剂耐药的CML细胞背景:通过靶向自噬HCQ不仅可以提高多种药物的抗肿瘤作用,还可以有效促进肿瘤的免疫清除,抑制低氧诱导的自噬可以提高肺癌细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性,抑制黑色素瘤细胞自噬也可以促进CTL杀伤黑色素瘤细胞,抑制自噬也可以增强IL2及某些肿瘤疫苗的治疗作用。免疫治疗已经成为白血病治疗的趋势,Vγ9Vδ2T细胞是一种具有很强肿瘤杀伤能力的免疫细胞,甚至可以有效杀伤TKIs耐药的CML细胞,是细胞免疫治疗的"明日之星"。本部分旨在研究HCQ是否能够促进Vy9Vδ2T细胞杀伤TKIs耐药的CML细胞,并揭示其作用机制。目的:探索自噬抑制剂—羟氯喹(HCQ)是否能够增强Vγ9Vδ2 T细胞对TKIs耐药CML细胞的杀伤,并进一步揭示其作用机制,为推动HCQ联合Vγ9Vδ2 T细胞免疫治疗在TKIs耐药CML治疗中的应用奠定基础。方法:以K562/GO1细胞(人CML伊马替尼耐药株)和K562细胞(人CML伊马替尼敏感株)为实验对象,通过Western Blot检测细胞内LC3Ⅱ、P62的表达、透射电子显微镜观察细胞内自噬小体的数量,分析HCQ对细胞的自噬抑制作用。以HCQ预处理的K562/GO1细胞和K562细胞为实验组靶细胞,PBS预处理的K562/GO1细胞和K562细胞为对照组靶细胞;以健康志愿者外周血来源的Vγ9Vδ2 T细胞为效应细胞。将CML细胞株与Vγ9Vδ2 T细胞以不同的效靶比共培养进行杀伤实验,比较实验组靶细胞和对照组靶细胞对Vγ9Vδ2T细胞敏感性的差别。靶细胞与效应细胞以1:1的效靶比共培养4h后,流式细胞仪检测Vγ9Vδ2T细胞的脱颗粒水平,分析不同靶细胞诱发Vγ9Vδ2 T细胞脱颗粒的差异,并利用CML患者来源的白血病细胞作为靶细胞再次验证脱颗粒实验的结果。采用shRNA敲降ATG7蛋白抑制细胞自噬,检测抑制自噬是否能够增强CML细胞对Vy9Vδ2 T细胞杀伤作用的敏感性,并检测HCQ是否能够增强ATG7敲降的CML细胞对Vγ9Vδ2 T细胞的敏感性,分析HCQ是否通过抑制自噬发挥增敏作用。流式细胞仪检测PBS或HCQ处理对CML细胞表面NKG2DL(MICA/B、ULBP1-6)表达的影响,并利用NKG2D阻断性抗体阻断Vγ9Vδ2 T细胞表面NKG2D与CML细胞表面NKG2DL的相互识别,分析诱导ULBP4(一种NKG2DL)在CML细胞膜表达是否为HCQ增强CML细胞对Vy9Vδ2 T细胞敏感性的机制。通过Western Blot、荧光定量PCR、流式细胞仪检测ULBP4的表达,共聚焦免疫荧光显微镜检测ULBP4在细胞内的分布揭示HCQ促进ULBP4表达的机制。结果:HCQ可以有效阻断K562/GO1细胞和K562细胞自噬,并且增强了K562/GO1和K562细胞对Vγ9Vδ2 T杀伤作用的敏感性。但敲降ATG7蛋白阻断细胞自噬并不能模拟HCQ的增敏作用,即使在ATG7敲降的K562/GO1和K562细胞中HCQ依旧可以提高Vγ9Vδ2 T对肿瘤细胞的杀伤作用,提示HCQ的增敏作用并不依赖于抑制肿瘤细胞自噬。HCQ诱导了 ULBP4在K562/GO1和K562细胞膜表达,阻断NKG2D与NKG2DL的相互识别后HCQ的增敏作用几乎消失,提示诱导ULBP4在CML细胞表面表达是HCQ促进Vy9Vδ2 T杀伤CML细胞的关键。进一步研究发现HCQ并没有提高ULBP4的转录及合成,而是诱导细胞内潴留的ULBP4转移到细胞膜。结论:HCQ诱导ULBP4从K562/GO1和K562细胞浆向细胞膜转移,促进了 Vy9V82 T细胞对K562/GO1和K562细胞的识别和杀伤。