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目的通过探讨DNA甲基化在胆红素所致神经损伤中的作用,提供以DNA甲基化修饰为靶点的小分子“靶向药物”研发的理论依据,为高胆红素血症的防治提供新的思路。方法(1)体外建立原代神经元培养体系:选择出生24h以内的SD大鼠,提取大脑皮质细胞,采用Neurobasal无血清培养基于37℃、5%CO2的恒温孵育箱中培养72h,用神经元特异性烯醇化酶免疫荧光法鉴定神经元。(2)实验分组和胆红素染毒:实验设对照组(0μmol/L)、低剂量组(25μmol/L)、中剂量组(50μmol/L)和高剂量组(100μmol/L)在避光环境下进行胆红素染毒,暴露24h后收集细胞进行后续检测。(3)细胞活性检测:采用MTT法,通过酶标仪测定570nm处各组的吸光光度值。(4)神经细胞凋亡率检测:采用Hoechst 33342荧光染色法,在显微镜下观察细胞凋亡情况。(5)神经元全基因组DNA甲基化水平检测:采用免疫荧光法,观察神经元的荧光强度。(6)DNA甲基转移酶蛋白表达水平检测:采用Western blot技术检测DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的蛋白表达水平。(7)DNMTs的mRNA表达水平检测:采用实时荧光定量PCR法检测神经元中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因的mRNA水平。(8)数据处理和统计分析:各组测定设4～8个平行样,检测结果以“均数±标准差”((?)±S)表示,多样本比较用单因素方差分析,样本间两两比较用SNK-q,检验水准α=0.05(双侧)。结果(1)采用神经细胞无血清原代培养技术建立高胆红素血症体外模型,镜下细胞密度适中、形态良好、生长旺盛,经鉴定培养细胞为神经元。(2)MTT检测结果显示,与对照组相比,胆红素染毒的皮质神经元在各剂量组的活性均降低(F=44.896,P<0.001),随染毒剂量的增加,细胞活性下降趋势呈明显的剂量-效应关系。(3)Hoechst33342荧光染色显示,胆红素暴露组可观察到神经细胞核边集、碎裂等改变;与对照组相比,各剂量组的神经元凋亡率显著升高(F=66.111,P<0.001),随着染毒剂量增加,凋亡率逐渐升高,呈明显的剂量-效应关系。(4)在胆红素暴露24h后,与对照组相比,低、中、高三个染毒剂量组的皮质神经元全基因组DNA甲基化水平均有所升高(F=10.925,P<0.001),且差异均具有统计学意义;中剂量组的甲基化水平达到最高,高剂量组DNA甲基化水平反而下降。(5)Western blot结果显示,与对照组比较,随着胆红素暴露剂量增加,DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的蛋白表达水平均有不同程度的升高(F=4.075～27.293,P<0.05)。其中,DNMT3A在低、中剂量组的表达与对照组相比明显上调(P<0.05),在高剂量组表达转而下降;DNMT3B在低、中、高剂量组的蛋白表达均有所增加,但与对照组相比,只有中剂量组的差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,DNMT1在各个剂量组的蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。(6)实时定量PCR检测结果显示,与对照组相比,随着胆红素暴露水平上升,三种DNMTs基因转录水平均有所升高(F=3.675～4.982,P<0.05)。其中,DNMT3A和DNMT3B在中、高剂量组的表达与对照组相比有所上调,但只有在高剂量组的上调水平具有显著性差异(P<0.05);与对照组相比,DNMT1在中、高剂量组的mRNA表达均显著上调(P<0.05),且差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论在本实验条件下,胆红素暴露可诱导大鼠皮质神经元DNA甲基转移酶蛋白和转录水平升高,进而导致DNA全基因组甲基化修饰水平升高,提示DNA甲基化修饰水平升高在胆红素导致的神经元损伤中扮演重要角色。