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RT-PCR及免疫组化检测VEGF-C及其受体Flt-4在原发性非小细胞肺癌中的表达及临床意义 目的 肿瘤细胞通过血管及淋巴管向其它器官扩散是恶性肿瘤的主要生物学特征。然而，关于肿瘤诱导的淋巴管生成的具体机制及其在肿瘤发展转移中的作用均未阐明。近年来发现的血管内皮生长因子C（VEGF-C）是血管内皮生长因子（VEGF）家族的新成员，是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂原，具有刺激血管和淋巴管生成的双重作用。国外研究发现，VEGF-C通过与其特异性受体（VEGFR-2/Flt-4）结合，引起一系列的信号转导，在多种肿瘤的生长、发展及转移中起着重要的调节作用。本研究分别采用半定量的RT-PCR及免疫组化染色（S-P法）法检测VEGF-C及Flt-4在非小细胞肺癌（NSCLC）及癌旁组织、转移的淋巴结组织中的表达，以了解VEGF-C及Flt-4在NSCLC中的发生、发展及淋巴转移中的作用，探讨与临床病理特征的关系，为肺癌的基因治疗提供理论依据。 材料与方法 一、RT-PCR法检测VEGF-C及Flt-4在mRNA水平的表达 1、研究对象：采用2003年9～12月经手术及病理证实的新鲜NSCLC标本40例，同时采用自身的癌旁肺组织12例。标本置于Eppendorf管中，液氮速冻，-70℃冰箱冷冻保存。 <WP=37> 2、常规方法提取总RNA。 3、引物序列：参照Primer5.0版电脑软件设计 VEGF-C及Flt-4 mRNA引物由大连博瑞得生物技术有限公司合成。 并同时设置内参照为β-actin（690bp），由北京奥科生物有限公司合成。 4、逆转录合成cDNA第一链：反应总体积为20ul。RT反应条件为：65℃预变性1min；30℃变性5min，65℃退火30min，15’-30’匀速升温，98℃延伸5min；5℃延伸5min。 5、PCR扩增：（1）VEGF-C 总反应体积为25ul。PCR条件：94℃预变性3min，94℃变性45Second，51℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸7min。（2）Flt-4 总反应体积为25ul。PCR条件：94℃预变性3min，94℃变性45 Second，55.5℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸7min。（3）β-actin 总反应体积为25ul。PCR条件：94℃预变性3min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，循环35次；72℃延伸7min。 6、产物分析：将分别扩增的VEGF-C、Flt-4和β-actin PCR产物一起于2%琼脂糖凝胶电泳（40’-60’，60V），溴化乙锭显色,测相对含量；同时设标记物为DNA Markers DL2,000（日本TaKaRa公司）为分子大小对照确定阳性琼脂糖凝胶电泳条带。电泳后，经凝胶成像分析系统摄影，用相应软件扫描仪测定PCR产物经溴化乙锭染色后强度（公式：VEGF-C的相对含量=VEGF-C密度/β-actin密度；F lt-4的相对含量=F lt-4密度/β<WP=38>-actin密度）。 7、统计学处理：计数资料用均数±标准差（±s）表示，采用χ2检验及Fisher确切概率检验；计量资料采用t检验，以上均在SPSS 10.0统计软件包上进行。 二、免疫组化法检测VEGF-C和Flt-4蛋白的表达 1、研究对象：标本来源于1998年1月至2003年10月手术切除的并经病理证实的NSCLC组织60例，另取10例癌旁肺组织做为对照组。分别行HE和免疫组织化学染色。 2、免疫组化染色：按S-P法试剂说明书进行。VEGF-C和Flt-4阳性表达定位于癌细胞胞质内，呈棕黄色颗粒。每张切片计数5个视野500个细胞，阳性细胞数占癌细胞总数＞10%为阳性。计数5个热区中Flt-4阳性微脉管数，取平均值。 3、统计学处理：数据用SPSS 10.0统计软件包，进行χ2检验、t检验及Kendall相关分析完成统计学处理。 实验结果 一、RT-PCR法检测VEGF-C和Flt-4在mRNA水平的表达 1、VEGF-CmRNA和Flt-4mRNA定性检测结果：RT-PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外透视仪下可见明显的特异产物带。VEGF-C mRNA及Flt-4 mRNA在肺癌中的表达均明显高于癌旁肺组织（P＜0.05、P＜0.001＝，并均与肺癌淋巴结转移正相关（均P＜0.05＝。VEGF-CmRNA表达与肺癌的TNM分期不相关。 2、VEGF-C和Flt-4mRNA定量检测结果：（1）NSCLC中VEGF-C mRNA及Flt-4 mRNA的相对含量均明显高于癌旁肺组<WP=39>织（P＜0.01，P＜0.001）；并与淋巴结转移正相关（均P＜0.01）。VEGF-CmRNA表达与肺癌的TNM分期正相关（P＜0.01＝。 二、免疫组化法检测VEGF-C和Flt-4在蛋白水平的表达 1、NSCLC组织中VEGF-C和Flt-4阳性表达率（分别为58.3%、71.7%）明显高于癌旁肺组织（分别P＜0.05、P＜0.01)。VEGF-C与Flt-4的表达呈正相关（P=0.023）。2、有淋巴结转移组的VEGF-C、Flt-4阳性率（为81.3%、87.5%）明显高于无淋巴结转移组（为32.1%、53.6%），差异有显著性（P＜0.01 、P＜0.01）。3、转移的淋巴结组织中，癌细胞VEGF-C、Flt-4阳性率分别为87.5%、90.6%，高于癌旁正常组织（P＜0.001 、P＜0.001）及NSCLC组织（P＜0.005、P＜0.05）。4、Flt-4阳性微脉管数在淋巴结转移组为19.59±4.56 ，未转移组为14.35±3.42，经t检验两组差异有显著性（P＜0.001）。5、VEGF-C的表达与肿瘤的TNM分期正相关（P＜0.05）。VEGF-C、Flt-4的表达与NSCLC组织类型、病理分级均无关。 讨论 VEGF-C是 VEGF家族的一个新?