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目的通过观察双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对人急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)细胞生长、凋亡的影响,验证DHA是否通过激活氧化应激诱导T-ALL细胞凋亡,并探讨DHA杀伤T-ALL细胞的分子机制。以此为基础,我们进一步观察DHA和三氧化二砷(Arsenic trioxide,ATO)单药或联合用药对T-ALL细胞生长、凋亡的影响,比较不同组别之间的差异,探讨DHA和ATO联用是否能增加对T-ALL细胞的毒性,协同诱导细胞凋亡,然后进一步研究DHA和ATO协同促进T-ALL细胞凋亡的分子机制。方法(1)对人T-ALL细胞株Jurkat细胞和MOLT-4细胞进行培育和传代,取对数生长期的细胞进行相关实验;(2)用不同浓度的DHA处理T-ALL细胞并设置对照组,观察不同组的细胞活力、增殖能力的变化(通过CCK8法、PI染色、克隆形成、Ed U染色免疫荧光等实验);(3)不同浓度的DHA处理T-ALL细胞并设置对照组,观察各组细胞活性氧(reactive oxygen species ROS)水平、凋亡率、凋亡蛋白C-Caspase-3活性水平的变化(通过DCFH-DA探针流式测定DCF的荧光强度、Annexin V-FITC/PI染色流式测凋亡率、免疫组化检测C-Caspase-3表达量等实验);(4)Western blot检测DHA处理后的细胞DNA损伤蛋白及凋亡相关蛋白的表达水平变化;(5)用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-cysteine,NAC)预处理细胞,再用DHA处理,并设置对照组,检测细胞ROS水平、活力、增殖能力、凋亡水平的变化,观察是ROS清除后是否能抑制DHA诱导的细胞凋亡,恢复细胞活力(采用CCK8法、流式检测ROS水平、Ed U染色免疫荧光、免疫组化C-Caspase-3活性测定等实验);(6)DHA和ATO单药或联合处理T-ALL细胞,并设置对照组,观察各组细胞活力、增殖能力的变化,比较联合用药和单药抑制细胞生长能力的差异(采用CCK8法、Ed U染色免疫荧光等实验);(7)用DHA和ATO单药或联合处理及NAC预处理T-ALL细胞,用流式细胞术检测细胞的DCF荧光强度来确定确定胞内的ROS水平,比较各组之间ROS产生量;(8)Western blot检测DHA和ATO单药或联合处理Jurkat细胞及对照组细胞的损伤蛋白γ-H2AX含量,比较各组间的γ-H2AX蛋白表达水平,评估联和用药与单药处理对细胞DNA损伤差异;(9)观察DHA和ATO单药或联合处理T-ALL细胞后各组细胞的凋亡率水平变化,评估两药联用诱导的细胞凋亡率是否高于两种单药诱导细胞凋亡率的叠加(采用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒流式测凋亡率、免疫组化C-Caspase-3活性测定等实验);(10)ROS清除剂NAC预处理后,观察DHA和ATO联合处理的T-ALL细胞活力和增殖能力是否有所恢复(通过CCK8法和Ed U染色免疫荧光实验)。结果(1)DHA能显著抑制T-ALL细胞株Jurkat细胞和MOLT-4细胞的活力和增殖能力,且呈剂量依赖性;(2)DHA能诱导细胞ROS产生,引起细胞凋亡,也呈剂量依懒性;(3)Western blot检测发现DHA处理Jurkat细胞后,DNA损伤蛋白γ-H2AX蛋白表达升高,抑癌基因p53、凋亡蛋白Bax、C-Caspase-3、Caspase-3、C-PARP蛋白水平表达也增高,而抗凋亡蛋白Bcl-2降低,并存在剂量依赖性;(4)NAC因能清除DHA诱导细胞产生的ROS而部分拯救DHA诱导的细胞凋亡,部分恢复DHA对细胞生长的抑制;(5)DHA和ATO联合用药对T-ALL细胞Jurkat细胞、MOLT-4细胞活力、增殖的抑制率要大于两种单药对细胞的生长抑制率之和,证实了DHA和ATO能协同抑制T-ALL细胞;(6)DHA联合ATO作用后Jurkat细胞增加的ROS水平的倍数要显著大于单药作用之和,证实ATO和DHA可以协同提高细胞ROS的产生,而ROS清除剂NAC预处理能部分降低ROS产生水平;(7)Western blot检测发现DHA、ATO联合作用Jurkat细胞后DNA损伤蛋白γ-H2AX表达水平要远大于单药作用之和,证实DHA、ATO能协同引起细胞DHA损伤;(8)Annexin V-FITC/PI染色流式凋亡检测和C-Caspase-3免疫组化测定结果显示,与对照组相比,经ATO或DHA处理的细胞凋亡率明显增加,而两药联合作用引起细胞的凋亡率的增加要大于两药单药引起细胞凋亡率之和,证实DHA、ATO能协同诱导T-ALL细胞凋亡;(9)NAC预处理后,DHA联合ATO处理的Jurkat细胞和MOLT-4细胞活力和增殖有所恢复。结论DHA通过激活氧化应激造成DNA损伤,激活p53凋亡通路诱导细胞凋亡,从而抑制T-ALL细胞生长。DHA和ATO可以通过激活氧化应激引起细胞DNA损伤,协同诱导T-ALL细胞凋亡。