论文部分内容阅读
目的1评价金水缓纤组分方II（Effective-component compatibility of Jinshui Huanxian formulaⅡ,ECC-JHF II）对博来霉素（Bleomycin,BLM）制备的肺纤维化（pulmonary fibrosis,PF）大鼠的干预效应,初步探讨其通过调控SETDB1抑制肺纤维化上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的机制。2阐释ECC-JHF II通过表观调控Snai1表达,抑制转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）诱导的人肺泡上皮细胞（A549）上皮间质转化的作用机制。方法第一部分金水缓纤组分方Ⅱ对PF大鼠的干预作用1 PF大鼠模型建立及药物干预将48只SD大鼠按随机数字表法分为4组,分别为:正常组（Control）、模型组（Model）、吡非尼酮（Pirfenidone,PFD）组和ECC-JHF II组,每组12只,雌雄各半。采用一次性气管内滴注BLM的方法建立PF大鼠模型。于第0天给予气管内滴入BLM,滴入量为5 mg/kg。正常饲养大鼠至第28天。第29～42日每天给予药物灌胃1次,正常组及模型组给予0.5%羧甲基纤维素-钠（CMC-Na）溶媒灌胃（0.5 m L/100 g）;治疗组分别给予PFD混悬液（108 mg/kg/d,0.5 m L/100g）和ECC-JHF II（4.72 mg/kg/d,0.5 m L/100 g）灌胃,第42天给药结束后进行动物取材。2指标检测通过HE及Masson染色观察大鼠肺组织病理结构及肺纤维化情况;采用蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）和免疫组化方法检测大鼠肺组织中SETDB1及H3K9me3的表达情况。第二部分组蛋白甲基转移酶SETDB1表观调控Snai1表达,抑制肺泡上皮细胞间质转化1 TGF-β1诱导细胞模型的建立以人肺泡上皮细胞（A549）为对象,采用蛋白免疫印迹法检测不同时间点、不同浓度TGF-β1对SETDB1、H3K9me3及EMT相关标志蛋白E-钙粘蛋白（Ecadherin,E-cad）、N-钙粘蛋白（N-cadherin,N-cad）、纤维连接蛋白（Fibronectin1,FN1）、波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin,α-SMA）的表达,筛选出TGF-β1的最佳浓度和最佳作用时间,建立细胞模型。2 siRNA敲低SETDB1对EMT相关蛋白的作用评价将A549细胞分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+NC组和TGF-β1+si-setdb1组,采用WB及q PCR方法检测SETDB1、H3K9me3和EMT相关基因和蛋白（E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、FN1、Snai1）的表达;采用细胞免疫荧光方法检测E-cadherin与FN1蛋白的表达。3过表达SETDB1对EMT相关蛋白的作用评价将A549细胞分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+cmv组和TGF-β1+setdb1组,采用WB法检测SETDB1、H3K9me3和EMT相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、FN1、Snai1）的表达。4 SETDB1对Snai1的表观调控作用将A549细胞分为对照组和TGF-β1诱导组,用染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）实验检测SETDB1调控Snai1基因启动子上H3K9me3的水平变化。第三部分金水缓纤组分方Ⅱ通过调控SETDB1/Snai1改善肺泡上皮细胞间质转化1 ECC-JHFⅡ浓度筛选及疗效评价以A549细胞为研究对象,给予不同浓度ECC-JHFⅡ处理,采用CCK8方法检测细胞活性,筛选出ECC-JHFⅡ的浓度范围。以TGF-β1诱导的A549细胞为研究对象,分为对照组、TGF-β1组和TGF-β1+不同浓度ECC-JHFⅡ处理组,采用WB方法检测不同浓度ECC-JHFⅡ对A549细胞EMT相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、FN1、Snai1）表达的影响。2 ECC-JHFⅡ对SETDB1、H3K9me3及EMT相关蛋白的调控作用评价将细胞分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+ECC-JHFⅡ组和TGF-β1+PFD组,采用WB方法检测61.25μg/m L ECC-JHFⅡ对SETDB1、H3K9me3及EMT相关蛋白表达的影响。3 ECC-JHFⅡ对SETDB1表观调控Snai1的作用评价将细胞分为对照组、TGF-β1组和TGF-β1+ECC-JHFⅡ组,采用Ch IP方法检测ECC-JHFⅡ对Snai1启动子上H3K9me3水平的影响。4 siRNA敲低SETDB1对ECC-JHFⅡ抑制EMT的影响将细胞分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+nc组、TGF-β1+si-setdb1组、TGF-β1+ECC-JHFⅡ组、TGF-β1+nc+ECC-JHFⅡ组、TGF-β1+si-setdb1+ECC-JHFⅡ组,采用WB方法检测SETDB1、H3K9me3及EMT相关蛋白的表达。结果第一部分金水缓纤组分方Ⅱ对PF大鼠的干预作用1对肺组织病理的影响相比于正常组,模型组大鼠肺泡壁破裂融合,结构紊乱,炎性细胞浸润增多,胶原纤维沉积增多;相比于模型组,ECC-JHFⅡ和PFD组肺组织病理征象得到改善。2对SETDB1和H3Kme3的影响WB结果显示,与正常组相比,模型组大鼠肺组织SETDB1、H3K9me3、Ecadherin表达减少,N-cadherin表达增加（P＜0.01）;与模型组相比,ECC-JHFⅡ和PFD组大鼠肺组织中SETDB1、H3K9me3、E-cadherin表达增加,N-cadherin表达减少（P＜0.01）。免疫组化结果显示,SETDB1和H3K9me3表达于正常组大鼠肺组织中;与正常组相比,模型组大鼠肺泡结构遭到破坏,SETDB1和H3K9me3阳性染色减少;与模型组相比,ECC-JHFⅡ和PFD组SETDB1和H3K9me3阳性染色增多。第二部分组蛋白甲基转移酶SETDB1表观调控Snai1表达,抑制肺泡上皮细胞间质转化1 TGF-β1诱导细胞模型的建立与对照组相比,5 ng/m L TGF-β1诱导A549细胞中N-cadherin、FN1、α-SMA蛋白表达显著上调,E-cadherin、SETDB1、H3K9me3蛋白表达显著下调（P＜0.05,P＜0.01）。并且TGF-β1引起的EMT相关蛋白表达水平变化与作用时间有关,48h时变化最显著。2 siRNA敲低SETDB1对EMT相关蛋白的作用评价siRNA干扰SETDB1加重了TGF-β1诱导的A549细胞长梭形细胞形态改变。siRNA干扰降低了SETDB1 m RNA及蛋白表达水平（P＜0.01）。与对照组相比,TGF-β1组E-cadherin、SETDB1、H3K9me3表达下调（P＜0.01）,N-cadherin、FN1、Snai1表达上调（P＜0.01）;与TGF-β1+nc组相比,TGF-β1+si-setdb1进一步加重了TGF-β1诱导的E-cadherin、SETDB1、H3K9me3表达下调（P＜0.01）,N-cadherin、FN1、Snai1表达上调（P＜0.01）。细胞免疫荧光结果显示,与TGF-β1+NC组相比,TGF-β1+si-setdb1组TGF-β1诱导的E-cadherin荧光强度减弱、FN1荧光染色增强。qPCR结果显示,与TGF-β1+nc组相比,TGF-β1+si-setdb1组TGF-β1诱导的α-SMA、N-cadherin、FN1、Snai1、MMP2、MMP9 m RNA表达水平升高（P＜0.01）。3过表达SETDB1对EMT相关蛋白的作用评价与TGF-β1+cmv组相比,TGF-β1+setdb1组SETDB1、E-cadherin蛋白表达显著升高（P＜0.01）,N-cadherin、FN1、α-SMA蛋白表达显著降低（P＜0.01）。4 SETDB1对Snai1的表观调控作用SETDB1可直接结合到Snai1基因启动子上,且TGF-β1诱导细胞导致了基因Snai1启动子上H3K9me3水平下调（P＜0.05）。第三部分金水缓纤组分方Ⅱ通过调控SETDB1/Snai1改善肺泡上皮细胞间质转化1 ECC-JHFⅡ浓度筛选及疗效评价与对照组相比,3.83～61.25μg/m L ECC-JHFⅡ组细胞活力无显著变化,122.5μg/m L ECC-JHFⅡ组细胞活力显著降低（P＜0.01）。与TGF-β1组相比,TGF-β1+30.63μg/m L ECC-JHFⅡ组、TGF-β1+61.25μg/m L ECC-JHFⅡ组、TGF-β1+91.88μg/m L ECC-JHFⅡ组及TGF-β1+PFD组E-cadherin蛋白显著上调,N-cadherin、Vimentin、α-SMA和FN1蛋白表达显著下调（P＜0.01）;其中TGF-β1+61.25μg/m L ECC-JHFⅡ组E-cadherin上调和N-cadherin和FN1下调最明显。显微镜镜下观察可见ECC-JHFⅡ抑制TGF-β1诱导的A549细胞长梭形细胞形态改变。2 ECC-JHFⅡ改善TGF-β1诱导的EMT与作用时间有关与TGF-β1组相比,ECC-JHFⅡ作用12h、24h可上调SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表达,下调FN1蛋白表达;作用24h、36h可下调Snai1、N-cadherin蛋白表达,上调E-cadherin表达（P＜0.01）。3 ECC-JHFⅡ改善TGF-β1诱导的Snai1启动子上H3K9me3下调与对照组相比,TGF-β1组Snai1启动子上H3K9me3水平减少（P＜0.05）;与TGF-β1组相比,TGF-β1+ECC-JHFⅡ组Snai1启动子上H3K9me3水平增加（P＜0.01）。4 siRNA敲低SETDB1抑制ECC-JHFⅡ对EMT的改善作用siRNA敲低SETDB1后,影响了ECC-JHFⅡ对EMT的抑制作用。与TGF-β1+nc+ECC-JHFⅡ组相比,TGF-β1+si-setdb1+ECC-JHFⅡ组SETDB1、H3K9me3、E-cadherin蛋白表达明显下调,Snai1、FN1、N-cadherin蛋白表达明显上调（P＜0.01）。结论1 ECC-JHFⅡ改善PF大鼠肺组织损伤和肺纤维化,通过上调SETDB1和H3K9me3表达以抑制EMT。2 ECC-JHFⅡ抑制肺泡上皮细胞EMT,其机制与表观抑制Snai1的表达有关。