芽孢杆菌Bs2004菌株的鉴定、抑菌作用及发酵配方优化研究

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芽孢杆菌Bs2004菌株是从土壤分离获得的一株生防芽孢杆菌,田间应用已证实该菌株能显著提高马铃薯、莴苣的产量,能有效防治油菜菌核病、十字花科蔬菜根肿病等经济作物的病害。为更好的开发利用该菌株,本研究对该菌株进行种类鉴定、液体培养条件、抑菌作用及液体发酵配方研究,现将研究结果报道如下:对芽孢杆菌Bs2004菌株的鉴定结果表明,其形态特征、培养性状以及生理生化特征均与伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)、《常见细菌系统鉴定手册》中描述的枯草芽孢杆菌的特征相符合,因此初步确定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。通过对Bs2004菌株培养条件如培养基种类、培养液初始pH值、培养温度、供氧条件、接种条件等的研究,Bs2004菌株摇瓶振荡的最适培养条件为:培养基为YSP,接种菌龄为12h,接种量为3%,初始pH值为7.5,培养温度为32℃,装液量为50mL/250mL,摇瓶转速为120r/min,培养时间为24h。通过对Bs2004菌株的抑菌机制研究表明,Bs2004菌株的菌体和非挥发性代谢产物对供试的油菜菌核病菌、立枯丝核菌、番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌、三叶草白绢病菌均有一定的抑菌作用。采用对峙培养法测定Bs2004菌株的菌体对上述5种病原菌菌丝的抑制作用,显微镜镜检发现,5种病原菌的菌丝都出现不同形态的畸形、原生质凝结等现象。采用培养基含毒介质法测定不同浓度的无菌滤液的抑菌活性表明:不同浓度的Bs2004菌株无菌滤液对5种供试病原菌菌丝生长均有一定的抑制作用,且浓度愈高,抑菌作用愈强,但不同病原菌之间存在显著差异,对油菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC50为7.95%,对三叶草白绢病菌菌丝生长的抑制作用最弱,EC50为31.00%。Bs2004菌株无菌滤液的稳定性测试结果表明,Bs2004菌株无菌滤液的抑菌活性易受酸碱处理的影响,但高温灭菌后仍然有较强的抑菌活性。本研究通过摇瓶培养从8种应用于芽孢杆菌发酵的供试发酵基础培养基中,筛选出适宜于芽孢杆菌Bs2004菌株生长的初始发酵培养基配方(蔗糖10g,玉米粉20g,黄豆粉15g,硫酸锰0.1g,硫酸镁0.1g,碳酸钙2g,酵母浸粉3g,硫酸亚铁0.02g,磷酸氢二钾2g,蒸馏水1000mL)。用SAS统计软件中Plackett-Burman设计对该初始发酵基础培养基作进一步的优化,从9个考察因素中筛选出硫酸镁、硫酸亚铁、黄豆粉和碳酸钙为四个重要显著因素,通过响应面分析法得到拟合效果较好的响应面方程:v=(157.429—1.625x5—1.875x8+3.4583x3—1.875X6—5.5967x52—0.8125x8x+5—5.9717x82—2.5625x3x5—0.5625x3x8—5.2217x32—1.0625x6x5+0.9375x6x8—2.0625x6x3—8.7217x6z)×107,推测出当培养基中硫酸镁为0.056g/L,硫酸亚铁为0.057g/L,碳酸钙为1.631g/L,黄豆粉为19.847g/L时,Bs2004菌株发酵液含菌量最大值为1.59×109cfu/mL,经摇瓶发酵实验验证此点的实测值为1.55×109cfu/mL,结果证实该回归方程有效,并且存在极大值点。在摇瓶条件下,优化后的发酵配方使芽孢杆菌Bs2004菌株发酵液的含菌量从8.92×108cfu/mL增加6.61×108cfu/mL,提高了43.14%。
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