小麦干旱胁迫响应基因TaSADR1的克隆及功能分析

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ld2001
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干旱胁迫是影响小麦生长,产量和品质的主要因素。水稻Os SADR1基因在干旱胁迫中起到负调控作用。本研究从小麦中克隆了Os SADR1的同源基因,命名为Ta SADR1,并对其基因结构,启动子序列,氨基酸序列以及进化关系进行了初步分析;利用q RT-PCR技术、原核表达、自身泛素化实验、亚细胞定位和酵母自激活分析其表达情况和蛋白功能,通过转基因获得过表达Ta SADR1基因的拟南芥,并在此基础上对Ta SADR1基因的功能进行探究,其结果如下:1.同源克隆获得中国春小麦Ta SADR1基因,其编码区全长1407bp,含有14个外显子;编码468个氨基酸,在N端有一个C3HC4类型的RING结构域。进化分析表明Ta SADR1与粗山羊草的遗传距离最近。表达分析表明,在幼苗期,Ta SADR1的表达量随着发育时间的增长而不断提高;在抽穗期,其表达量存在组织差异性,在茎中的表达量最高,在幼穗中表达量最低。在PEG600、ABA、盐、热和冷胁迫下,Ta SADR1基因均有响应。2.原核表达分析表明,Ta SADR1基因能够借助p Cold-TF载体在大肠杆菌BL21中表达,经SDS-PAGE分析,其表达的融合蛋白大小约为105k Da(Ta SADR1蛋白50k Da),空载p Cold-TF所表达的蛋白约55k Da,其大小与计算所得一致。自身泛素化实验证实Ta SADR1蛋白能够在E1、E2和Ub存在的条件下形成泛素链,表明Ta SADR1蛋白具有泛素化活性。亚细胞定位分析表明Ta SADR1基因在烟草细胞中定位于细胞核。酵母自激活证明Ta SADR1基因全长没有自激活功能。3.转基因拟南芥萌发实验结果表明,在甘露醇模拟的干旱胁迫和盐胁迫下,转基因拟南芥的长势,根长和发芽率都显著低于野生型拟南芥,在ABA的作用下转基因拟南芥的萌发明显受到抑制,表明过表达Ta SADR1基因降低了拟南芥对干旱和盐胁迫的抗性,增加了对ABA的敏感性。4.在干旱胁迫中,转基因拟南芥干旱10天后株叶片萎蔫,茎秆干枯,而野生型拟南芥叶片虽也有所萎蔫,但相对转基因拟南芥长势稍好,且复水后野生型拟南芥得到恢复而转基因拟南芥枯萎死亡。生理指标测定表明,过表达Ta SADR1基因降低了拟南芥对水分的保持能力,细胞膜的通透性增加,细胞的稳态降低,过氧化物酶的活性降低,而细胞内有害物质积累增加。对非生物胁迫响应基因(RD29A,RD29B,DREB2A和P5CS1)的定量分析表明,过表达Ta SADR1基因抑制了这四个非生物胁迫响应基因对干旱的响应。这都表明该基因在干旱胁迫中起负调控的作用。综上所述,我们成功克隆出Os SADR1基因在小麦中的同源基因Ta SADR1。该基因定位于细胞核,响应干旱和ABA处理,其蛋白具有E3泛素连接酶活性,是干旱胁迫中的一个负调控因子。
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