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无浆体病（Anaplasmosis）是由无浆体科(Anaplasmataceae)无浆体属(Anaplasma)的无浆体感染宿主血细胞引起的蜱传疾病。该病主要引起宿主发热、贫血、消瘦、黄疸等临床症状，严重者可导致宿主死亡，增加养殖成本，造成经济损失，同时对人类健康也存在一定的威胁。国内外报道的无浆体包括7种，分别为嗜吞噬细胞无浆体(A naplasma phagocytophilum，AP)、山羊无浆体(A.capra)、绵羊无浆体（A.ovis）、牛无浆体（A.bovis）、扁平无浆体(A.platys)、边缘无浆体(A.marginale)、中央无浆体（A.centrale）。其中AP和A.capra已证实为人兽共患病原，A.ovis作为潜在人兽共患病原，已广泛引起人们的重视。目前，显微镜观察血涂片和血清学检测是无浆体常用的检测方法，但这两种方法特异性低、敏感性差、容易造成假阳性及漏检现象。分子检测技术由于其特异性强、敏感性高已广泛应用于各种病原检测。本研究旨在建立敏感性高、特异性强的AP、A.capra和A.ovis3种人兽共患病原的分子检测技术，以期为三种无浆体病的临床病原检测和流行病学调查提供技术支持。
1.嗜吞噬细胞无浆体重组酶聚合酶扩增技术的建立与初步应用
为建立快速、灵敏的重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)检测AP，根据AP16S rRNA基因序列(JN558811，KP062962，JN558815)设计4对RPA引物，经RPA引物筛选和条件优化，建立了检测AP的RPA方法，并对其进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测。结果表明，引物RPA-4-F/R可作为特异性扩增AP的最适引物;该方法在38℃的水浴锅中反应30min，10μM引物量为2.0μL时扩增效率最佳;与A.bovis、A.ovis、A.capra、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、羊附红细胞体（Mycoplasma ovis）、绵羊泰勒虫（Theileria ovis）、吕氏泰勒虫（T.luwenshuni）和环形泰勒虫（T.annulata）基因组DNA无交叉反应;RPA技术的DNA最低检测浓度为1.77×10-5ng/μL，比文献报道的巢式PCR敏感10倍;具有良好的重复性;临床样品检测结果表明，本试验建立的RPA方法检出率与报道的巢式PCR检出率差异不显著（P＞0.05）。本研究建立的RPA方法敏感性高、特异性强、重复性好，可为快速、准确检测无浆体病的临床病原检测提供新的技术支持。
2.基于绵羊无浆体Groel基因的PCR检测方法建立与应用
利用A.ovis高度保守的Groel基因，建立了快速、特异、敏感的A.ovis检测方法。根据GenBank上登录的A.ovis Groel基因序列(FJ460438)，设计1对特异性引物，经过条件优化，建立了A.ovis PCR方法，并对其进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测。结果显示，该方法能特异性地检测A.ovis，与A.capra、AP、A.bovis、A.maginale、T.luwenshuni、T.ovis、M.ovis、T.gondii基因组DNA均无交叉反应;该方法检测下限可达到77×10-7ng/μL，比文献报道的PCR（MSP4基因）敏感10倍;具有良好的重复性;对81份羊临床血液样品检测结果表明，本试验建立的PCR方法对A.ovis的阳性检测率为32.1％(26/81)，高于已报道PCR方法(18.5％，15/81)。本研究建立的PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好，可为绵羊无浆体病的早期诊断及临床检测提供可资借鉴的技术。
3.绵羊无浆体和山羊无浆体双重PCR方法的建立与初步应用
应用特异性扩增A.ovis Groel基因的引物，与报道的A.capra MSP4基因的特异性引物相结合，经过条件优化，建立了A.ovis和A.capra双重PCR方法，并对其进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测。结果表明，该方法能特异性扩增A.ovis(～335bp)和A.capra(～656bp)，AP、A.bovis、A.maginale、T.luwenshuni、T.ovis、M.ovis、莫氏巴贝斯（Babesia motasi）、T.gondii的基因组DNA均无特异性扩增，表明该方法特异性较好;A.ovis和A.capra的最低检测限分别为77×10-6ng/μL和50×10-6ng/μL;重复性良好;分别应用单PCR方法和双重PCR对62份临床血液DNA样品检测A.ovis和A.capra，结果显示，单PCR和双重PCR对于A.ovis和A.capra的检出率差异不显著（P＞0.05）。本研究建立的高效、快速、准确的A.ovis和A.capra双重PCR方法对于两种无浆体病的早期诊断和流行病学调查具有重要的意义。
1.嗜吞噬细胞无浆体重组酶聚合酶扩增技术的建立与初步应用
为建立快速、灵敏的重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)检测AP，根据AP16S rRNA基因序列(JN558811，KP062962，JN558815)设计4对RPA引物，经RPA引物筛选和条件优化，建立了检测AP的RPA方法，并对其进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测。结果表明，引物RPA-4-F/R可作为特异性扩增AP的最适引物;该方法在38℃的水浴锅中反应30min，10μM引物量为2.0μL时扩增效率最佳;与A.bovis、A.ovis、A.capra、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、羊附红细胞体（Mycoplasma ovis）、绵羊泰勒虫（Theileria ovis）、吕氏泰勒虫（T.luwenshuni）和环形泰勒虫（T.annulata）基因组DNA无交叉反应;RPA技术的DNA最低检测浓度为1.77×10-5ng/μL，比文献报道的巢式PCR敏感10倍;具有良好的重复性;临床样品检测结果表明，本试验建立的RPA方法检出率与报道的巢式PCR检出率差异不显著（P＞0.05）。本研究建立的RPA方法敏感性高、特异性强、重复性好，可为快速、准确检测无浆体病的临床病原检测提供新的技术支持。
2.基于绵羊无浆体Groel基因的PCR检测方法建立与应用
利用A.ovis高度保守的Groel基因，建立了快速、特异、敏感的A.ovis检测方法。根据GenBank上登录的A.ovis Groel基因序列(FJ460438)，设计1对特异性引物，经过条件优化，建立了A.ovis PCR方法，并对其进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测。结果显示，该方法能特异性地检测A.ovis，与A.capra、AP、A.bovis、A.maginale、T.luwenshuni、T.ovis、M.ovis、T.gondii基因组DNA均无交叉反应;该方法检测下限可达到77×10-7ng/μL，比文献报道的PCR（MSP4基因）敏感10倍;具有良好的重复性;对81份羊临床血液样品检测结果表明，本试验建立的PCR方法对A.ovis的阳性检测率为32.1％(26/81)，高于已报道PCR方法(18.5％，15/81)。本研究建立的PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好，可为绵羊无浆体病的早期诊断及临床检测提供可资借鉴的技术。
3.绵羊无浆体和山羊无浆体双重PCR方法的建立与初步应用
应用特异性扩增A.ovis Groel基因的引物，与报道的A.capra MSP4基因的特异性引物相结合，经过条件优化，建立了A.ovis和A.capra双重PCR方法，并对其进行特异性、敏感性、重复性试验及临床样品检测。结果表明，该方法能特异性扩增A.ovis(～335bp)和A.capra(～656bp)，AP、A.bovis、A.maginale、T.luwenshuni、T.ovis、M.ovis、莫氏巴贝斯（Babesia motasi）、T.gondii的基因组DNA均无特异性扩增，表明该方法特异性较好;A.ovis和A.capra的最低检测限分别为77×10-6ng/μL和50×10-6ng/μL;重复性良好;分别应用单PCR方法和双重PCR对62份临床血液DNA样品检测A.ovis和A.capra，结果显示，单PCR和双重PCR对于A.ovis和A.capra的检出率差异不显著（P＞0.05）。本研究建立的高效、快速、准确的A.ovis和A.capra双重PCR方法对于两种无浆体病的早期诊断和流行病学调查具有重要的意义。