【摘 要】
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在心肌梗死(Myocardial infarction,MI)发生后,梗死区心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)大量增殖,并分化为肌成纤维细胞(Myofibroblast,MFB),引起胶原纤维为主的细胞
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在心肌梗死(Myocardial infarction,MI)发生后,梗死区心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)大量增殖,并分化为肌成纤维细胞(Myofibroblast,MFB),引起胶原纤维为主的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)分泌增多,从而导致心肌发生纤维化(Myocardial fibrosis,MF)。CFs是MF进程的主要效应细胞,约占人类心脏细胞总数的60%~70%,是心脏中数目最多的一类细胞。大量研究表明与MF相关的miRNAs和基因可以通过影响CFs的细胞功能,继而调控MF进程。本课题前期通过冠状动脉降支结扎的方式,构建五指山小型猪MI模型,假手术组小型猪同样进行开腔手术,但不结扎。分别收集梗死区、梗死交界区、正常心肌组织进行miRNAs转录组测序,获取了与MI相关的差异miRNAs,选择差异极显著的miR-144-3p和miR-590-3p为候选miRNAs。本研究运用EdU荧光显微镜检测、Transwell assay、qRT-PCR和Western blot等实验技术研究miR-144-3p和miR-590-3p对CFs功能影响;并利用双荧光报告系统、qRT-PCR和Western blot验证了候选miRNAs发挥功能的靶基因。本研究结果如下:1.miR-144-3p/miR-590-3p模拟物(mimic)与抑制剂(inhibitor)转染至CFs后,利用EdU荧光显微镜检测发现,miR-144-3p能促进CFs增殖,miR-590-3p能抑制CFs增殖,用Transwell assay检测后发现miR-144-3p能够促进CFs迁移,miR-590-3p能抑制CFs迁移。进一步用qRT-PCR与Western blot检测结果显示,CFs中转染miR-144-3p模拟物后α-SMA、Col1A1、Col3A1的mRNA和蛋白表达增高,而miR-590-3p抑制CFs中α-SMA、Col1A1、Col3A1的mRNA和蛋白表达。2.根据Targetscan、Pitar和RNAHybrid基因数据库的预测结果,我们选择第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)为miR-144-3p的候选靶基因,锌指E盒结合的同源盒蛋白1(Zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)为miR-590-3p的候选靶基因。进一步进行双荧光活性检测发现转染有PTEN/ZEB1野生型3’UTR载体时,与对照组相比荧光素酶活性显著下调。qRT-PCR与Western blotting结果表明miR-144-3p能够在mRNA水平和蛋白水平抑制PTEN的表达,而miR-590-3p仅在蛋白水平负调控ZEB1的表达。3.抑制靶基因PTEN的表达会促进CFs的增殖、迁移等,表明PTEN的功能与miR-144-3p的功能相反;而下调靶基因ZEB1时,则抑制CFs的增殖、细胞的迁移等,表明ZEB1的功能也与miR-590-3p的功能相反。本研究通过探索miR-144-3p和miR-590-3p调控心脏成纤维细胞的功能,为深入研究心脏成纤维细胞与心肌梗死后纤维化过程的关系奠定基础,对于人类心肌梗死的诊断与治疗具有潜在价值。
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