第一部分糖尿病肾病是糖尿病的最主要微血管并发症,严重威胁人类健康,进入终末期肾脏替代治疗后大量消耗卫生经济资源。目前对糖尿病肾病发病机制尚未被完全阐释,针对糖尿病肾病也缺乏安全有效的特异性治疗。近年来,可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase, sEH)在肾脏疾病尤其是糖尿病肾病的发病中所起的作用逐渐被重视,有可能成为糖尿病肾病治疗的新靶点。目的：本研究拟通过检测糖尿病肾病患者肾组织中sEH表达变化,验证sEH是否在糖尿病肾病状态下高表达,研究sEH表达量与尿蛋白水平的相关性。从蛋白表达及其功能水平,比较自发性糖尿病大鼠和正常大鼠编码sEH蛋白的EPHX2基因型对细胞NF-κB炎症通路、TNF-α诱导的凋亡通路及胆固醇合成影响的差异性。从启动子水平探讨糖肾方对糖尿病肾病的治疗作用是否与调节EPHX2基因启动子活性有关,揭示糖肾方的潜在治疗作用机制。方法：1.sEH蛋白在糖尿病肾病患者肾组织中表达变化的研究：选取2011年4月至2014年7月期间住院行肾穿刺的患者,对比糖尿病肾病患者肾组织样本与IgA肾病患者肾组织样本中sEH表达差异,同时以肾癌患者手术切除的癌旁组织作为正常对照。所有病例均需符合相应的临床诊断,并经肾穿刺活检确诊。以自动切片机将石蜡包埋的肾穿刺样本制成6μm厚的石蜡切片,脱蜡后进行sEH的免疫组织化学染色,光学显微镜下观察sEH的表达分布,Image-Pro Plus6.0软件对染色进行半定量分析,比较各组sEH表达差异。用SPSS 20.0统计软件对sEH免疫染色的平均光密度和各样本相应的24小时尿蛋白定量水平行Pearson相关性分析,了解sEH在肾组织的表达量与尿蛋白水平是否存在一定的关联关系。2.自发性糖尿病OLETF大鼠和正常LETO大鼠EPHX2基因型对细胞NF-κB炎症通路、TNF-α诱导的凋亡通路及胆固醇合成影响的差异性研究：(1)构建EPHX2基因高表达的大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E细胞模型：以2型糖尿病OLETF大鼠和具有相同遗传背景但不发病的LETO大鼠肾皮质cDNA为模板,根据GeneBank中大鼠EPHX2 mRNA CDS序列和缺失了5’端198个碱基的短片段EPHX2-X1 mRNA CDS序列分别设计引物,上游引物5’端引入EcoRV酶切位点GATATC,下游引物5’端引入Xba1Ⅰ酶切位点TCTAGA,高保真酶扩增4个不同的cDNA片段。利用p-UCT DNA连接试剂盒,将扩增出的cDNA片段克隆至p-UCT载体,再把连接正确的片段亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-A,最后经酶切鉴定及DNA测序验证所构建质粒是否含有正确的插入片段。以Lipofectamine2000转染试剂将4种不同类型的重组质粒及pcDNA3.1/V5-His-A空载体转染至NRK-52E细胞,同时转染绿色荧光蛋白GFP,荧光显微镜下观察转染效率。Western Blot检测融合蛋白的表达,RT-PCR方法检测重组质粒转染后EPHX2基因在细胞内转录水平的表达。(2) TNF-α刺激转染不同类型重组质粒的NRK-52E细胞,研究sEH高表达对细胞炎症状态及凋亡的作用：sEH对炎症的促进作用主要是由其水解抗炎介质EETs所实现的,本项实验首先检测构建的各重组质粒对EETs的水解功能差异：将4种不同类型重组质粒转染至NRK-52E细胞,以空质粒转染组为对照,细胞培养液中补充足量的11,12-EET,或在补充EET的同时加入sEH抑制剂TPPU. ELISA方法检测各组细胞培养液中的EET水解产物11,12-DHET浓度变化,观察各组细胞在质粒转染后成功表达的sEH蛋白是否具有活性,同时比较各重组质粒在sEH的水解功能是否存在差异。细胞转染后以20ng/ml浓度的细胞因子TNF-a刺激1小时诱导细胞产生炎症,另一组细胞在加入TNF-a的同时加入11,12-EET,观察转染了不同类型重组质粒的NRK-52E细胞与空载体组比较细胞的炎症状态差异Real time-PCR和Western blot法分别检测NF-κB炎症通路相关分子p65、IκBαMCP-1、IL-1βPPARα、PPARγ表达变化,以及TNF-α诱导的凋亡相关指标TNFR1、caspase-3、Bcl-2表达变化。(3)不同类型重组质粒转染后对细胞胆固醇合成的影响：将4种不同类型重组质粒转染至NRK-52E细胞,以空质粒转染组为对照,另一组细胞在转染后加入sEH抑制剂TPPU。ELISA方法检测此时细胞培养液上清中总胆固醇含量,Real time-PCR和Western blot法检测此时胆固醇合成的限速酶HMGCR表达变化。3.中药糖肾方对人EPHX2启动子片段活性的调控作用研究：将人EPHX2基因启动子重组质粒hEPHX2/pGL3瞬时转染至HEK-293T细胞中,转染后向细胞培养液中加入以传统工艺生产的糖肾方配方颗粒继续培养24小时,双萤光素酶报告基因法检测不同浓度的糖肾方对人EPHX2启动子活性的影响。把4种含不同长度人EPHX2基因启动子片段的重组质粒hEPHX2F0.7/pGL3-basic(-690-+28), hEPHX2F1.0/pGL3-basic(-1027-+28). hEPHX2F2.5/pGL3-basic(-2527-+28) hEPHX2F4.8/pGL3-basic(-4757-+28)分别瞬时转染至HEK-293T细胞中,再分别以400μM、600μM和800gM浓度的H202刺激转染后细胞4小时,双萤光素酶报告基因法检测不同浓度的对各启动子片段活性的影响。结果：1.sEH在糖尿病肾病患者肾组织中的表达情况：sEH特异性的表达于肾小管上皮细胞胞浆中,近端小管的阳性着色明显强于远端小管。各级肾小血管、出球小动脉、入球小动脉均未见特异性着色,肾小球及肾间质不着色。糖尿病肾病组的免疫组化平均光密度高于正常组及IgA肾病组,与正常组相比差异具有统计学意义(p<0.05)。sEH表达量与蛋白尿水平的Pearson相关性分析结果表明sEH与尿蛋白水平呈正相关。2.成功构建了LETO型及OLETF型EPHX2/pcDNA3.1/V5-His-A重组质粒、EPHX2-X1/pcDNA3.1/V5-His-A重组质粒,并经酶切鉴定及DNA测序验证含有正确的插入片段。通过收集转染后48h的细胞,Western blot方法检测V5标签抗体的表达,表明相应的含EPHX2全长插入片段的两种重组质粒(EPHX2-L. EPHX2-0)能够在转染后的NRK-52E细胞中实现了过表达；而缺失5’端198个碱基的两种重组质粒(EPHX2-X1-L、 EPHX2-X1-0)转染后,融合蛋白表达量相对较低,不能实现过表达。进一步RT-PCR显示,4种类型重组质粒转染至细胞后所扩增出的EPHX2目的片段表达量无差异,故推测构建的重组质粒在转录水平实现了高表达。对比Western Blot检测出的融合蛋白表达差异,表明EPHX2-X1重组质粒在细胞内未实现高表达发生在转录后的翻译水平,可能与细胞内的翻译调控作用相关,具体机制尚待进一步实验证实。因此在后续实验中仅检测EPHX2全长的两种质粒之间的差异。当细胞培养液中加入11,12-EET后,she过表达组细胞培养上清中11,12-DHET的量显著上调,L型与O型之间无明显差异；细胞培养液中加入11,12-EET的同时给予sEH抑制剂TPPU,可显著下调11,12-DHET含量至基础水平。以上结果表明转染后细胞内过表达的sEH融合蛋白具有较强的水解活性,L型、O型两种EPHX2重组质粒在水解功能上无差异。重组质粒转染后p-p65、p65蛋白表达较空质粒转染组上调,而IκBα水平未见明显变化。加入TNF-α诱导细胞炎症后,p-p65表达在重组质粒转染组表达继续上调,p65表达无明显变化,IκBα在各组均显著下降但组间差异不明显。在TNF-α刺激前2小时加入11,12-EET可降低各组p-p65水平、增加κBα,减轻细胞炎症。重组质粒转染组细胞因子IL-1p的表达在TNF-α刺激时显著上调,11,12-EET同样也可抑制IL-1β表达升高。转染EPHX2重组质粒后,凋亡相关指标TNFR1、caspase-3表达量较空载体转染组显著增加,上调的程度在L型和O型之间未见明显差异。在加入TNF-α后,各组TNFR1表达量进一步上调,并且TNFR1、caspase-3的表达可被11,12-EET所抑制,抑制的程度在L型和O型之间未见差异。凋亡抑制蛋白Bcl-2在sEH过表达后和加入TNF-α后,与空质粒转染组比较均有不同程度的表达下降,下降各组间未见差异。sEH过表达后可使细胞中胆固醇合成的限速酶HMGCR表达上调,加入TPPU后该上调更为显著。尽管O+TPPU组较L+TPPU组的总胆固醇、HMGCR表达量的有所升高,但差异无统计学意义。以上表明sEH水解活性(C端)抑制后,可促进胆固醇合成。间接证明其N端对胆固醇合成具有促进作用。3.4.8kb的人EPHX2启动子重组质粒转染进入HEK293T细胞后,与pGL3空载体组相比萤光素酶活性显著上调,说明重组质粒具有较高的启动子活性。经过不同浓度的糖肾方干预后,与未刺激组相比萤光素酶活性未见明显变化,表明在正常条件下100-750μg/ml浓度范围内的糖肾方不能对此人EPHX2启动子片段的活性产生影响。在400μM浓度下即可检测出H202对各长度的EPHX2启动子片段活性均有上调作用,600μM浓度时对1.0kb、2.5kb及4.8kb启动子均有继续上调的趋势。而加大至800μM浓度后,各片段启动子活性降低至接近未刺激对照组水平。结论：sEH在糖尿病肾病患者肾组织内表达出现显著上调。自发性糖尿病OLETF大鼠和正常LETO大鼠两种不同EPHX2基因型对细胞炎症、凋亡及胆固醇合成方面的影响未显示出差异,表明这样的基因多态性对sEH蛋白的功能没有明显改变。当前的实验表明中药糖肾方对糖尿病肾病的治疗作用可能不是通过上调sEH启动子片段实现的。人EPHX2启动子对H2O2导致的氧化应激具有很好的应答,故氧化应激可作为sEH后续相关研究的重点。第二部分目的：观察中药益气清热膏对嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside, PAN)肾病大鼠肾组织炎症、肾实质细胞凋亡的影响,探讨益气清热膏治疗作用的分子机制。方法：36只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、PAN模型组、益气清热膏组,每组各12只。除假手术组予等量生理盐水外,其余各组大鼠采用颈静脉插管一次性注射PAN造模。分别在造模前(0天)与造模后的第3天、5天、10天、15天检测24小时尿蛋白定量；第10天、15天分批处死,检测血生化,取肾组织行光镜和电镜检查；实时定量PCR法、免疫组化法检测肾组织炎症相关指标TNF-a及受体TNFR1、IL-1β、单核细胞趋化因子MCP-1、单核／巨噬细胞标记物CD68在肾组织中的表达；实时定量PCR法、Western blot检测肾组织中凋亡相关指标cleaved-caspase3与Bcl-2的表达；TUNEL染色观察凋亡。结果：①造模后出现了大量蛋白尿和高脂血症,肾组织病理损伤主要表现为足细胞足突肿胀、丢失,肾小管大量蛋白管型形成。益气清热膏有明显的改善作用。②模型组肾组织炎症相关指标表达明显上调,益气清热膏可抑制该炎症反应③模型组出现明显肾实质细胞凋亡,益气清热膏能减少TUNEL染色阳性的凋亡细胞数。益气清热膏能降低caspase-3 mRNA及蛋白的表达,以第10天最为显著(P<0.05),同时还具有升高Bcl-2蛋白表达的趋势(P<0.05)。结论：益气清热膏可减轻PAN模型大鼠肾损伤,其作用的主要环节可能与其抑制肾组织炎症、减少肾脏实质细胞凋亡有关。