第一部分IVF出生小鼠及其之间交配出生后代行为学、形态学及全基因组甲基化模式的研究目的：通过IVF小鼠模型的建立,完成以IVF为代表的ART出生群体之间婚育安全性动物模型方面的评估,揭示ART的对人类未来可能的表观遗传学效应。材料和方法：1.建立IVF小鼠模型,获得IVF出生F1代小鼠；6-7周龄时,IVF F1代小鼠雌雄性合笼,自然交配受孕,获其F2子代；2.,以自然出生小鼠为对照,分别于6-7周龄时,进行F1代,F2代小鼠的水迷宫实验,评价其学习及记忆能力；3.以自然出生小鼠为对照,开展F1代,F2代小鼠的体重、器官测量,外表结构畸形观察、组织器官的大体和组织形态学检测和分析；4.应用小鼠全基因组甲基化芯片,对F1代及F2代小鼠及自然妊娠出生小鼠各四只进行全基因组水平的甲基化的检测,比较三组全基因组水平的甲基化的模式；5.选取8个在F1、F2代同时发生高甲基化的启动子位点Cryga、Fgf1、Nos3、Mb、Myog、Notch3、Th釉Vavl以及4个只有在F2代发生高甲基化的启动子位点：Col9a2、Fgf6、Lck和Slc5al进行亚硫酸氢盐测序,对芯片的部分结果进行验证；6.采用荧光定量PCR方法检测经亚硫酸氢盐测序证实在F1代阳性的位点Fgf1、Nos3、Notch3、Th和Vavl以及在F2代的阳性位点Col9a2、Fgf1、Fgf6、Nos3、Notch3、Slc5a1、Th及Vavl的表达,明确甲基化状态其对其mRNA表达情况的影响。结果：1.成功建立IVF F1代小鼠模型及F2代模型；2.水迷宫实验显示IVF F1、F2代组与自然妊娠出生小鼠相比在潜伏期、游泳距离等方面无显著性差异；3. IVF F1、F2代的体重、器官比重及组织形态学与自然妊娠出生小鼠相比无显著性差异；4.小鼠脑组织全基因组甲基化芯片结果显示,在F1代中共有225个CpG岛及191启动子区域发生了高甲基化；22个CpG岛和28启动子区域发生了低甲基化。F2代有196个CpG岛和213个启动子区域高甲基化；69个CpG岛,56个启动子发生了低甲基化。F1代与F2代相比,共有113个启动子和143个CpG岛发生了共同的高甲基化；5.在经亚硫酸氢盐测序验证的8个启动子中,Fgf1、Nos3, Notch3、Th及Vavl在F1、F2代甲基化的程度较自然妊娠组高,差异有显著性,符合芯片发现的结果。4个只在F2代发生高甲基化的位点中,有3个发生了高甲基化,符合芯片的发现；6.荧光定量PCR方法显示Fgf1、Nos3、Notch3、Lck, Co19a2、Fgf6及Slc5a1的表达受到其甲基化状态得影响,其mRNA的表达有不同程度的降低,但Th、Vavl没有显示这种趋势。结论：1. IVF对F1、F2代小鼠的学习和记忆能力、生长发育及器官形态等没有明显的影响；2.IVF出生小鼠脑组织基因组DNA甲基化修饰存在改变,尤以高甲基化异常明显,并可影响到基因的表达；3. IVF出生小鼠的部分基因组DNA甲基化修饰异常可以传递给其相互交配出生的后代,同时这些后代也有新的DNA甲基化修饰异常发生,此类异常甲基化同样可影响基因的表达。第二部分IVF所致异常甲基化向后代传递的遗传方式研究目的：分析IVF出生小鼠基因组DNA异常甲基化的子代传递方式,为探索异常甲基化发生机制和可能阻断途径提供研究基础。材料和方法：1.将IVF出生的雌性及雄性F1代小鼠分别与野生型雄性及雌性小鼠交配获得母源和父源IVF F2代小鼠；2.选取3个前期研究中发现在F1、F2代同时发生高甲基化位点：Fgfl、Nos3、Notch3以及3个只有在F2代发生高甲基化位点：Col9a2、Fgf6、Slc5a4,分别在母源和父源IVFF2代小鼠考察上述启动子区域的甲基化模式；3.荧光定量PCR方法检测Fgf1、Nos3、Notch3、Col9a2、Fgf6及Slc5al在母源和父源IVF F2代小鼠中枢神经系统中的表达,明确甲基化状态其对其mRNA表达的影响。结果：1.2个在IVF F1和F2代同时发生高甲基化的位点：Fgf1、Notch3以及3个只有在IVF F2代发生高甲基化位点：Col9a2. Fgf6和Slc5a1,在母源IVF F2代小鼠脑组织中,其甲基化程度与自然妊娠出生小鼠无显著差异。但Nos3仍表现出高甲基化,且荧光定量PCR结果显示Nos3基因的表达也存在不同程度的降低；2.3个在IVF F1和F2代同时发生高甲基化的位点：Fgf1、Nos3、Notch3以及3个只有在F2代发生高甲基化位点：Col9a2、Fgf6及Slc5al,在父源IVF F2代小鼠的脑组织中,其甲基化程度与自然妊娠出生小鼠均无显著差异。结论：1. IVF F1代雄性小鼠发生的基因组DNA甲基化修饰异常,在其后代可得以纠正；2. IVF F1代雌性小鼠发生的甲基化修饰异常,存在传递给其后代的风险；3. IVF出生小鼠相互交配出生的F2代小鼠的异常甲基化可能主要是通过母源传递。第三部分Nos3启动子在母源F3代的甲基化状态及IVF出生双胎子代脐血印迹基因调控区KvDMRl、H19/IGF2 DMR及PEG1的甲基化状况目的：进一步考察在母源IVF F2代小鼠中发生异常的Nos3位点是否可以进一步传递；研究IVF双胎子代脐血中几个重要印记基因调控区的甲基化状况,分析IVF双胎子代中印迹状态异常风险。材料和方法：1.将论文第二部分的母源IVF F2代进一步与野生型的C57/BL6J雄性小鼠之间交配,获的母源IVF F3代,以自然妊娠子代为对照；同时荧光定量RT-PCR进一步检测Nos3所调控基因的mRNA表达水平2.共收集59对双胎脐血标本,其中29对IVF双胎组成研究组,30对自然妊娠双胎组成对照组,采用亚硫酸氢盐测序对两个母源性甲基化印记区域(KvDMR1、PEG1)及一个父源性甲基化印记区域(H19/IGF2 DMR)进行甲基化模式检测和比较。结果：1.在母源IVF F2代小鼠中异常甲基化的Nos3位点在母源IVF F3代与自然妊娠出生的小鼠相比已无差别,Nos3基因表达水平到母源F3代已经无显著性变化；2.IVF和自然妊娠双胎子代均未发现有PEG1基因的印记缺失,二组甲基化程度无显著性差异(P=0.103)。3例IVF双胎子代中存在KvDMR1低甲基化,甲基化程度在21%左右,发生率为5.08%(3/58),1例自然妊娠双胎子代存在低甲基化,发生率为1.67%(1/60),二者相比,无统计学差异(P=0.611)。IVF和自然妊娠双胎子代各有1例存在H19/IGF2 DMR的高甲基化,二组甲基化程度没有显著性差异(P=0.103)。结论：1.在F1代和母源IVF F2代发生异常高甲基化的Nos3启动子位点在母源IVF F3代得到了纠正；2.虽然没有发现IVF和自然妊娠双胎子代在KvDMR1, H19/IGF2 DMR及PEG1的甲基化模式和程度的统计学差异,但IVF子代较多的异常甲基化人数仍然提示IVF可能存在一定的表观遗传风险,有关结论优待增加样本的进一步研究。