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第一部分构建大鼠PPARy基因的tet-on慢病毒载体,体外实验确定载体对大鼠BMSCs成脂与成骨分化的影响目的分离、培养大鼠BMSCs。构建大鼠PPARy基因shRNA的Tet-on慢病毒载体,并转染大鼠BMSCs,在四环素的诱导下确定其沉默效应及对大鼠BMSCs成脂与成骨分化的影响。方法采用贴壁法分离培养大鼠BMSCs, SABC法进行鉴定。针对大鼠PPARγ基因特异序列,通过质粒重组、病毒包装及测序验证,构建pTRIPZ/PPARy-shRNA慢病毒载体,设空白对照组(Control组)、非特异性质粒转染组(shNTC)、慢病毒质粒转染组(shPPARγ)。分别转染大鼠BMSCs后,在四环素诱导下确定其沉默效应及最佳四环素诱导浓度。成脂诱导后RT-PCR检测成脂基因C/EBPα ADD1 mRNA的表达,Western blotting检测C/EBPα ADD1蛋白的表达,油红O染色检测其成脂细胞分化。成骨诱导后RT-PCR检测成骨基因collagenI和Cbfa1/Runx2的表达,Western blotting检测collagen I和Cbfa1/Runx2蛋白的表达,通过茜素红染色、钙含量分析及ALP活性测定检测成骨细胞分化。结果通过贴壁法可获得较纯化的大鼠BMSCs, SABC法鉴定细胞表面表达CD44, CD54, CD71,不表达CD34, CD45。构建针对大鼠PPARy基因的四环素诱导慢病毒载体pTRIPZ/PPARy-shRNA测序结果与设计的序列相符合,滴度为3.6×10E8 TU/ml,转染大鼠BMSCs后可表达红色荧光蛋白,转染效率70%以上。在20μg/ml的四环素诱导下可达到92%的沉默效果。成脂诱导后shPPARβ组相对于Control组ADD1、C/EBPαmRNA及蛋白表达明显降低(P<0.01),shNTC组与Control组比较差异无统计学意义(P>0.05),成脂诱导2w后各组细胞油红O染色结果,shPPARγ组细胞脂滴聚集明显减少,成脂分化明显受阻。各组细胞成骨诱导培养后,shPPARγ组相对于Control组collagen Ⅰ、Cbfa1/Runx2 mRNA及蛋白表达明显上调(P<0.05),而shNTC组与Control组差异无统计学意义(P>0.05)。成骨诱导2w后各组细胞茜素红染色结果,shPPARy组细胞红色钙结节大量聚集,成骨分化明显增强,钙含量测定结果,shPPARγ组细胞明显高于Control组及shNTC组,成骨诱导2w后各组细胞ALP活性测定,shPPARγ组细胞明显高于Control组及shNTC组,shNTC组与Control组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建大鼠pTRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒载体,转染大鼠BMSCs后,在四环素诱导下可获得稳定的沉默效应。体外实验对大鼠BMSCs有抑制成脂、促进成骨的作用。第二部分 四环素在大鼠股骨中的代谢动力学研究目的探讨四环素在大鼠股骨骨组织及骨髓组织的代谢规律。方法36只大鼠随机分为12组,一个对照组及11个时间点组,对照组给予生理盐水灌胃,其余大鼠采用四环素灌胃。分别在不同时间点取股骨骨组织及骨髓组织采用蛋白沉淀法提取样本,以甲硝唑为内标,采用高效液相色谱串联质谱法测定每个样本中四环素含量,绘制时间-浓度曲线。取各个时间点的大鼠股骨,经过NaOH溶液处理后,在荧光显微镜下观察其荧光强度,并绘制时间-荧光信号强度曲线。结果通过高效液相色谱串联质谱法在股骨及骨髓中检测出四环素药物峰,并绘制标准曲线,定量限2.5μg/kg,精密度、回收率均符合检测要求。根据测量的各个时间点的四环素量,在股骨骨组织灌胃后48-72h四环素可达最高峰,以后不再增加。在骨髓组织中灌胃后12h达到最高峰浓度,以后浓度逐渐减小。荧光显微镜观察72h后荧光强度最高,以后不再增加。结论四环素在大鼠股骨骨组织中48-72h即可达到最大浓度,并趋于稳定。在骨髓组织中12h达到峰浓度,以后浓度逐渐减小。第三部分 四环素诱导靶向pTRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒载体对GIOP大鼠的治疗效果目的建立大鼠GIOP模型,研究四环素诱导靶向pTRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒载体对GIOP大鼠的治疗作用。方法32只SD雄性大鼠随机分为4组,每组8只。对照组(Control组)给予皮下注射生理盐水5mg/kg/d,每周5次；激素组(Met组)皮下注射甲强龙5 mg/kg/d,每周5次,建立GIOP模型；四环素灌胃组(Tet组)：在Met组基础上给予四环素100 mg/kg/d灌胃,每周两次;基因治疗组(shPPARy组)：在Met基础上给予给予四环素100 mg/kg/d灌胃,12h后向股骨骨髓腔内注射TRIPZ/PPARy-shRNA慢病毒颗粒,每周两次。8周后测量各组大鼠体重、血清生化指标及股骨和L3椎体骨密度,制作骨切片,Micro-CT、HE染色观察骨显微结构变化,比较各组大鼠骨形态计量学指标及骨生物力学参数。结果(1)体重方面：实验前各组大鼠体重无明显差异(P>0.05),8周后Met组低于Control组(P<0.01)；Tet组与Met组差异不明显(P>0.05)；shPPARγ组明显高于Met组(P<0.01)；(2)血生化指标：Met组总胆固醇、血清Ca明显高于Control组(P<0.01),血清ALP明显低于Control组(P<0.01)；Tet组血钙明显低于Met组(P<0.01),总胆固醇、血清ALP与Met组无明显差异(P>0.05)；shPPARγ组总胆固醇、血清Ca明显低于Met组(P<0.05),血清ALP明显高于Met组(P<0.05); Met组、Tet组及shPPARy组血磷均低于Control组(P<0.05),但三者之间无明显差异(P>0.05)。(3)股骨及L3椎体骨密度测定：Met组明显低于Control组(P<0.01);Tet组、shPPARγ组骨密度较Met组明显升高(P<0.05)；且shPPARγ组明显高于Tet组(P<0.05)。(4) Micro CT分析：Met组与Control组比较骨小梁稀疏,测得骨密度显著降低(P<0.01); Tet组与Met组比较股骨骨小梁无明显变化(P>0.05),但腰椎骨小梁增多,骨密度增加(P<0.01);shPPARy组与Met组、Tet组比较,骨小梁增多,测得骨密度明显升高(P<0.01)。(5)HE染色：Met组与Control组比较,骨小梁中的骨细胞数目减少,绝大部分细胞排列杂乱,网状连接破坏；Tet组较Met组骨小梁数目有增多,部分结构变得整齐；shPPARy组与Met组比较,骨小梁排列明显紧密、有序,骨小梁数目明显增多,网状结构基本恢复。(6)骨形态计量学分析：Met组%Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th均较Control组下降,而Tb.Sp指标较Control组上升(P<0.01); Tet组%Tb.Ar、Tb.N较Met组升高,Tb.Sp降低(P<0.05),但Tb.Th与Met组无明显差异(P>0.05); shPPARγ组%Tb.Ar、Tb.N、 Tb.Th旨标均较Met组上升,Tb.Sp降低(P<0.01)；且shPPARy组与Tet组比较所有指标均有显著性差异(P<0.05)。(7)骨生物力学分析：Met组较Control组最大载荷、最大扰度、最大应力明显降低(P<0.01); Tet组与Met组比较差异无统计学意义(P>0.05)：shPPARy组三项指标均高于Met组、Tet组(P<0.05)结论皮下注射甲强龙5 mg/kg/d,每周5次,可建立GIOP模型。四环素诱导靶向pTRIPZ/PPARy-shRNA慢病毒载体对GIOP大鼠具有治疗作用,效果优于单纯使用四环素。