家蚕BmAWD基因的表达、纯化和亚细胞定位

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在对本实验室构建的家蚕蛹期cDNA文库测序中,我们筛选到一条编码AWD(abnorma.win.disc)蛋白的cDNA序列,将其命名为BmAWD基因。通过生物信息学分析,发现该基因序列全长为68.bp,ORF框为46.bp,编码154个氨基酸残基,含有一个NDPK保守结构域。通过PCR扩增获得该基因ORF框并克隆到表达载体pGEX-5X-1上,得到重组表达质粒pGEX-5X-1-AWD,将该重组子转化大肠杆菌BL21,经PCR、酶切鉴定证明重组正确。在37℃下以IPTG诱导表达后收集菌体并裂解,SDS-PAGE分析发现在4.kD左右处有一特异性蛋白条带,与预期值相符,但目的蛋白主要以沉淀即包涵体形式存在,25℃下诱导表达,SDS-PAGE分析表明目的蛋白主要存在于上清中。采用亲和层析法纯化融合蛋白GST-AWD,并免疫新西兰大白兔,制备GST-AWD多克隆抗体,ELISA检测该多克隆抗体的效价可达到1:16000,Wester.blot检测显示该抗体对GST-AWD有特异性识别能力。亚细胞定位表明蛋白BmAWD同时存在于Bm5细胞的细胞质及细胞核中。提取五龄蚕的各个组织和各个时期(卵,幼虫,蛹,蛾)的总RNA,进一步用荧光相对定量PCR检测表明BmAWD在表皮中表达量最高,脂肪体中表达量最低,在蛹期中表达量最高,在卵期表达量最低。   AWD基因为昆虫翅盘异常发育基因,它编码一个具有NDP激酶活性的蛋白亚基,NDP激酶除了催化核苷二磷酸(NDP)和核苷三磷酸(NTP)之间高能磷酸基团的转移外,还具有蛋白磷酸转移酶活性。本研究将为了解家蚕BmAWD基因在家蚕中的转录、表达等情况,探讨家蚕BmAWD基因在家蚕生长、发育过程中的功能打下基础。
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